Labtutorials.org

Archive for August, 2013|Monthly archive page

Restrikciós analízis (Restrikciós enzimek)

In molecular biology on August 27, 2013 at 2:22 pm

A restrikciós analízis olyan molekuláris biológiai módszer, melyhez restrikciós endonukleázokat, röviden restrikciós enzimeket alkalmaznak.  A restrikciós enzimeket plazmidok hasítására használják.  Ezek az enzimek a baktériumban immunfunkciót látnak el. A baktériumban páronként jelennek meg: DNS metiláz és maga a restrikciós enzim vagy más néven endonukleáz. Mindketten ugyanazt a szekvenciát ismerik fel.  A baktérium szekvencia specifikus módon metilálja a saját DNS-ét. Ezáltal az védett lesz minden más idegen DNS-től.  Minthogy a horizontális génátvitel eléggé gyakori a baktériumban, így az meg tudja védeni a saját genetikai anyagát a restrikciós enzimek segítségével.  Az idegen DNS belépve  a sejtbe eltérő DNS metiláló mintát fog bemutatni. A metilálatlan felismerési szakaszt a restrikciós enzim levágja és ezáltal tönkreteszi.

A különböző baktérium törzseknek különböző restrikciós enzimei vannak, melyeknek  eltérő a felismerési szakasza ( természetesen mindegyiknek van DNS metiltranszferáza is).

Egy molekuláris biológiai laborban arra használjuk a restrikciós enzimeket, hogy hasítsuk és ezáltal manipuláljuk a plazmidokat.  Olyanok mint az olló, ami a rá specifikus részeket tudja kivágni a plazmidból, hogy megtisztítsa azt.

A restrikciós endonukleázoknak három típusa ismert: az I. III.  típusok molekuláris biológiai szempontból már nélkülözhetőek, míg a II-es típus nélkülözhetetlen.

Tulajdonságaik:

  •  csak endonukleáz aktivitásuk van, azaz a metilálást mindig egy másik enzim fogja végezni. A II-es típusnál van egy módosító enzimpár is a metiláló mellett.
  • mindig ugyanott, ugyanúgy, adott enzimre jellemző felismerési szekvencián belül vagy annak közelében hasítja a DNS-t
  • működésükhöz ATP nem szükséges, Mg2+ viszont kell!!!

Isoschizomereknek nevezzük azokat az enzimeket, amik azonos szekvenciát ismernek fel és azonos helyen hasítanak.

Neoschizomereknek nevezzük azokat az enzimeket, melyeknek csak a felmerési szekvenciájuk azonos, hasítási helyük különböző.

Nézzünk meg néhány alap restrikciós enzim használatot:

YOUTUBE – Restrikciós enzimek

Mindig amikor enzimekkel dolgozunk feltétlen gumikesztyűt kell húznunk, és az enzimet jégen tartanunk!!!

A restrikciós enzimek egysége a U (unit) az a mennyiség ami ideális körülmények között, egy óra alatt egy mikrogramm plazmid hasításához szükséges.

Egy tipikus restrikciós enzimmel végzett reakciót az alábbi példán szemléltetjük:

Hasítást végző restrikciós enzim:  EcoRI.

Jelentése: E= nemzetség Escherichia

co= faj coli

R= törzs

I= elsőként izolált endonukleáz

Protokoll ( minden gyakorlat előtt egy tervet készítünk,hogy mi szerint végezzük majd a feladatunkat ) :

1. A restrikciós reakció komponenseit jégre tesszük és kiolvasztjuk. Az enzimet glicerollal együtt tároljuk Eppendorf csövekben -20°C-on. A glicerol azért szükséges,hogy az enzimünk ne fagyjon meg. Használat előtt az enzimet tartalmazó csövet vortexeljük,hogy kicsit felkavarjuk.

2. Összemérjük jégen a reakciókat. Példánkban a végtérfogat 50 ul.

Így ennek megfelelően 37 ul NFW-t (nukleáz mentes vizet), 5 ul 10x-es hígítású   EcoRI puffert, 7ul 1ng-os templát DNS-t és 1ul 10U/ul-es enzimet mérünk össze.

3. Ezt követően 30 percig inkubáljuk 37°C-os vízfürdőben.

Néhány általános szabály amit jó tudni :

  • az enzim a lehető legrövidebb ideig tartózkodjon -20°C feletti hőmérsékleten
  • az enzim glicerolban oldott, és az gátolhatja a hasítást, így általános szabály, hogy a teljes reakciótérfogat max. 10%-a lehet az enzim
  • enzimenként eltérő a puffer összetétele
  • a reakció utolsó hozzáadott komponense mindig az enzim!!!
  • ha tovább szeretnénk vinni a reakciót pl. ligálási reakcióhoz,  célszerű hőinaktiválni ( ált. 65°C, 20 perc, enzimfüggő )
  • lehet egy csőben dupla hasítást végezni, de ekkor figyelni kell a pufferegyeztetésre
  • szuboptimális körülmények közt “star” aktivitás jelentkezik

Belepillanthatsz a módszer alkalmazásába az alábbi videóban.

YOUTUBE – Restrikciós emésztés és klónozás

Sok szerencsét!

Andi és Flóra

Advertisements