Labtutorials.org

Archive for 2015|Yearly archive page

Beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekciót követően

In molecular biology on May 9, 2015 at 10:16 pm

β-gal aktivitás vizsgálat:

Génexpressziós vizsgálatoknál – DNS-fehérje, fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatánál – normalizálóként használják a B-gal aktivitás eredményét.

  1. A 36 órás transzfekciós inkubáció (PEI transzfekció c. alfejezet) letelte után felkaparjuk a sejteket a plate lyukaiból, lyukanként átpipettázuk eppendorf csövekbe a sejteket.
  2. Centrifugáljuk – 250g, 2 perc, szobahő, a felülúszót leszívjuk, 1x szobahős PBS-ben felszuszpendáljuk a sejteket. ( még egy mosási lépést beiktathatunk, ez opcionális).
  3. Ismét centrifugáljuk, a felülúszót leszívjuk, 250μl lízis pufferben felszuszpendáljuk őket.
  4. -70°C-ra helyezve lefagyasztjuk a sejteket, majd felolvasztjuk őket és ismét lefagyasztjuk.
    (A fizikai sokk és a lízis puffer hatására a sejtek lizálódnak, a b-gal enzim kiszabadul a sejtből.)
  1. Egy eppendorf csőbe 80μl sejtlizátumhoz 100μl β-gal szubsztrát oldatot pipettázunk.
  2. Pár percet várunk, az enzim reakció hatására be kell sárgulnia a sejtlizátum-oldat elegynek.

Megjegyzés: A lízis lépés gyakran eltér lízispuffer összetételtől függően. Amennyiben  a bGal esszét normalizálásra használjuk, a lizátum többi részét pl. a Luciferáz enzim aktivitásának mérésére használjuk fel, amely korrelál bizonyos génexpressziós szabályozási lépések megtörténtével/mértékével. Ilyenkor mindkét aktivitást egy VICTOR elnevezésű plate olvasó készülékkel kvantitáljuk, az enzimek szubsztrátjainak jelenlétében.

Oldatok összetétele:

  • 5x lízis puffer (100ml): ezt kell 5-szörösére hígítani MQ vízzel
  • 1,25ml 0,5M Tris (pH 7.8)
  • 1ml 1M DTT
  • 10ml 0,1M EDTA (pH 8.0)
  • 50ml glycerol
  • 5ml Triton-X-100
  • 40,75ml MQ víz
  • β-gal szubsztrát oldat (4ml-re):
  • 4ml β-gal puffer (200ml puffer összetétele: 120ml 0,1M Na2HPO4 + 80ml 0,1M NaH2PO4 + 2ml 1M KCl + 2ml 0,1M MgCl2)
  • 35μl β-markapto-etanol
  • 8mg ONPG (orto-nitrophenyl-β-galaktopiranozid)

PEI transzfekció

In molecular biology on May 9, 2015 at 10:07 pm

Transzfektálás:

Transzfekció fogalmán DNS eukarióta sejtbe való juttatását értjük, ez történhet fizikai vagy biokémiai módszerrel. A DNS sejtben maradásának időtartama szerint lehet tranziens vagy stabil a transzfekció. Tranziens transzfekcióval átmeneti kifejeződést érhetünk el, stabil transzfekciónál a bejuttatott DNS beépülhet a transzfektált sejt genomjába.

Módszerek:
Biokémiai módszerek: kalcium-foszfát mediált, dietilaminoetil(DEAE)-dextrán mediált, lipid mediált transzfekció (PEI, Lipofectamine, FuGene)

Fizikai módszerek: elektroporáció, direkt mikroinjektálás, génpuska

Virális módszer: retrovirális géntranszfer

Mi a biokémiai módszerek közül általában lipid mediált módszert alkalmazunk PEI (polietilénimin)-oldat használatával. A PEI transzfekció megfelelő hatásfokú letapadó sejtek esetén, rutinszerűen alkalmazzuk fehérjetermeltetéshez szükséges plazmidok bejuttatásához és az ún. kotranszfekciós “riporter esszé” típusú kísérleteknél.

Szükséges anyagok, eszközök:

  • steril lamináris fülke
  • T293 sejtek (humán embrionális vese sejt)
  • 6 lyukú sejjtenyésztő plate
  • 10 % FBS tartalmú DMEM médium (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
  • 1% FBS tartalmú médium
  • plazmidok (VDR-1, β-gal)
  • szűrt, 150 mM NaCl oldat
  • PEI oldat
  • szerológiai pipetták, pipettor
  • automata pipetták, pipettahegyek
  • eppendorf csövek

A transzfekciót megelőző nap elvégzett műveletek:

  1. “PLATELÉS”: Sejteket tettünk 6-lyukú plate-re. 1 lyukba 300 000 sejtet tettünk 2ml médiumban (10% FBS tartalmú DMEM)
    (A sejtek platelése a passzálás főbb lépéseivel egyeznek meg: a sejtekről leszívjuk a médiumot 2. 2-3ml PBS-sel mossuk őket 3. 1-2ml tripszin-EDTA-val leválasztjuk a flaska aljáról a sejteket 4. a tripszin mennyiségének minimum 2-szeresének megfelelő 10%FBS DMEM-mel leállítjuk a tripszint 5. Bürker-kamra segítéségével megszámoljuk a sejteket 6. a kívánt sejtszámot megfelelő mennyiségű friss médiummal kimérjük)
  2. 16-18 órán keresztül inkubáljuk a sejteket a transzfekciót megelőzően, mialatt letapadnak és log fázisba kerülnek.

TRANSZFEKCIÓ:

6 lyukú plate 1 lyukára számolva a DNS-PEI mix összetétele az alábbiak szerint alakul:

DNS-mix PEI-mix Összmennyiség(DNS-PEI mix) (µl)
DNS (µg) Kiegészítve NaCl-al  (µl-re) PEI (µl) Kiegészítve NaCl-al  (µl-re)
3 100 6 100 200

Az alábbiak szerint fogjuk a plazmidokat transzfektálni lyukanként:

  1.     Transzfekció előtt 1 órával cserélje le a sejteken a médiumot 1ml 1% FBS tartalmú médiumra! (éheztetés)
  2.     Számolja ki a plazmidok koncentrációja alapján, hogy hány μl plazmidra és NaCl-ra van szükség lyukanként!

Mindkét plazmid 1µg/µl-es tehát:

plazmid NaCl
1.      lyuk 3µl VDR-1 97µl
2. lyuk 1,5µl VDR-1 + 1,5µl β-gal 97µl
3. lyuk 3µl β-gal 97µl
  1. Pipettázzon 3 eppendorf csőbe 97-97µl NaCl oldatot és ehhez pipettázza hozzá a megfelelő plazmidot a megfelelő térfogatban!
  2. A 6 lyukú plate 3 lyukára számolva pipettázzon egy eppendorf csőbe 18μl PEI-oldatot és 282μl NaCl oldatot! Rázza össze!
  3. A DNS-NaCl mixekre pipettázzon 100μl-t a PEI-mixből lassan cseppenként adagolva! Rázza össze őket!
  4. Inkubálja a DNS-PEI mixet 20 percig szobahőmérsékleten!
  5. Pipettázza a sejtekre a DNS-PEI mixet lassan cseppenként adagolva!Slide1
  6. Inkubálja a sejteket 5-6 órát 37°C-on, 5% CO2 tartalom mellett!
  7. Adjon a sejtekhez 1ml 10%FBS tartalmú médiumot!
  8. Inkubálja a sejteket 36 órát 37°C-on, 5% CO2 tartalom mellett!
  9. beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekcót követően (köv. alfejezet)

Oldatok összetétele:

  • 1% FBS tartalmú médium (50ml-hez):
  • 50ml üres DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
  • 0,5ml szűrt, hő kezelt FBS (Fetal Bovine Serum)
  • 0,5ml L-glutamin
  • 0,5ml penicillin-streptomycin
  • PEI-oldat:
  • 4,5 mg PEI 10ml MQ vízben feloldva
  • 6,5-7,5 közöttire kell beállítani a pH-ját
  • 0,2μm-es szűrőn át kell szűrni

Jegyzetek:

A VDR-1 és bGal plazmidokat gyakran használjuk kotranszfekciós esszékben. A bGal egy transzfekciós normalizáló plazmid, minden egyes sejttenyésztő lyukra normalizálható vele a transzfekciós hatékonyság (mix és sejtszám-függő) – a plazmid által kódolt b-galaktozidáz enzim aktivitásának mérésével. A VDR-1 úgynevezett “puffer plazmid”, ha eltérő mennyiségben használunk bizonyos plazmidokat egy-egy lyukban, VDR-1-gyel egészítjük ki hogy minden kondícióban a totál transzfektált DNS mennyiség azonos legyen.

A beta-galaktozidáz enzim aktivitásának mérése:

“beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekcót követően” c. alfejezetben!