Labtutorials.org

Beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekciót követően

In molecular biology on May 9, 2015 at 10:16 pm

β-gal aktivitás vizsgálat:

Génexpressziós vizsgálatoknál – DNS-fehérje, fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatánál – normalizálóként használják a B-gal aktivitás eredményét.

  1. A 36 órás transzfekciós inkubáció (PEI transzfekció c. alfejezet) letelte után felkaparjuk a sejteket a plate lyukaiból, lyukanként átpipettázuk eppendorf csövekbe a sejteket.
  2. Centrifugáljuk – 250g, 2 perc, szobahő, a felülúszót leszívjuk, 1x szobahős PBS-ben felszuszpendáljuk a sejteket. ( még egy mosási lépést beiktathatunk, ez opcionális).
  3. Ismét centrifugáljuk, a felülúszót leszívjuk, 250μl lízis pufferben felszuszpendáljuk őket.
  4. -70°C-ra helyezve lefagyasztjuk a sejteket, majd felolvasztjuk őket és ismét lefagyasztjuk.
    (A fizikai sokk és a lízis puffer hatására a sejtek lizálódnak, a b-gal enzim kiszabadul a sejtből.)
  1. Egy eppendorf csőbe 80μl sejtlizátumhoz 100μl β-gal szubsztrát oldatot pipettázunk.
  2. Pár percet várunk, az enzim reakció hatására be kell sárgulnia a sejtlizátum-oldat elegynek.

Megjegyzés: A lízis lépés gyakran eltér lízispuffer összetételtől függően. Amennyiben  a bGal esszét normalizálásra használjuk, a lizátum többi részét pl. a Luciferáz enzim aktivitásának mérésére használjuk fel, amely korrelál bizonyos génexpressziós szabályozási lépések megtörténtével/mértékével. Ilyenkor mindkét aktivitást egy VICTOR elnevezésű plate olvasó készülékkel kvantitáljuk, az enzimek szubsztrátjainak jelenlétében.

Oldatok összetétele:

  • 5x lízis puffer (100ml): ezt kell 5-szörösére hígítani MQ vízzel
  • 1,25ml 0,5M Tris (pH 7.8)
  • 1ml 1M DTT
  • 10ml 0,1M EDTA (pH 8.0)
  • 50ml glycerol
  • 5ml Triton-X-100
  • 40,75ml MQ víz
  • β-gal szubsztrát oldat (4ml-re):
  • 4ml β-gal puffer (200ml puffer összetétele: 120ml 0,1M Na2HPO4 + 80ml 0,1M NaH2PO4 + 2ml 1M KCl + 2ml 0,1M MgCl2)
  • 35μl β-markapto-etanol
  • 8mg ONPG (orto-nitrophenyl-β-galaktopiranozid)
Advertisements