Labtutorials.org

Archive for the ‘molecular biology’ Category

Beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekciót követően

In molecular biology on May 9, 2015 at 10:16 pm

β-gal aktivitás vizsgálat:

Génexpressziós vizsgálatoknál – DNS-fehérje, fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatánál – normalizálóként használják a B-gal aktivitás eredményét.

  1. A 36 órás transzfekciós inkubáció (PEI transzfekció c. alfejezet) letelte után felkaparjuk a sejteket a plate lyukaiból, lyukanként átpipettázuk eppendorf csövekbe a sejteket.
  2. Centrifugáljuk – 250g, 2 perc, szobahő, a felülúszót leszívjuk, 1x szobahős PBS-ben felszuszpendáljuk a sejteket. ( még egy mosási lépést beiktathatunk, ez opcionális).
  3. Ismét centrifugáljuk, a felülúszót leszívjuk, 250μl lízis pufferben felszuszpendáljuk őket.
  4. -70°C-ra helyezve lefagyasztjuk a sejteket, majd felolvasztjuk őket és ismét lefagyasztjuk.
    (A fizikai sokk és a lízis puffer hatására a sejtek lizálódnak, a b-gal enzim kiszabadul a sejtből.)
  1. Egy eppendorf csőbe 80μl sejtlizátumhoz 100μl β-gal szubsztrát oldatot pipettázunk.
  2. Pár percet várunk, az enzim reakció hatására be kell sárgulnia a sejtlizátum-oldat elegynek.

Megjegyzés: A lízis lépés gyakran eltér lízispuffer összetételtől függően. Amennyiben  a bGal esszét normalizálásra használjuk, a lizátum többi részét pl. a Luciferáz enzim aktivitásának mérésére használjuk fel, amely korrelál bizonyos génexpressziós szabályozási lépések megtörténtével/mértékével. Ilyenkor mindkét aktivitást egy VICTOR elnevezésű plate olvasó készülékkel kvantitáljuk, az enzimek szubsztrátjainak jelenlétében.

Oldatok összetétele:

  • 5x lízis puffer (100ml): ezt kell 5-szörösére hígítani MQ vízzel
  • 1,25ml 0,5M Tris (pH 7.8)
  • 1ml 1M DTT
  • 10ml 0,1M EDTA (pH 8.0)
  • 50ml glycerol
  • 5ml Triton-X-100
  • 40,75ml MQ víz
  • β-gal szubsztrát oldat (4ml-re):
  • 4ml β-gal puffer (200ml puffer összetétele: 120ml 0,1M Na2HPO4 + 80ml 0,1M NaH2PO4 + 2ml 1M KCl + 2ml 0,1M MgCl2)
  • 35μl β-markapto-etanol
  • 8mg ONPG (orto-nitrophenyl-β-galaktopiranozid)

PEI transzfekció

In molecular biology on May 9, 2015 at 10:07 pm

Transzfektálás:

Transzfekció fogalmán DNS eukarióta sejtbe való juttatását értjük, ez történhet fizikai vagy biokémiai módszerrel. A DNS sejtben maradásának időtartama szerint lehet tranziens vagy stabil a transzfekció. Tranziens transzfekcióval átmeneti kifejeződést érhetünk el, stabil transzfekciónál a bejuttatott DNS beépülhet a transzfektált sejt genomjába.

Módszerek:
Biokémiai módszerek: kalcium-foszfát mediált, dietilaminoetil(DEAE)-dextrán mediált, lipid mediált transzfekció (PEI, Lipofectamine, FuGene)

Fizikai módszerek: elektroporáció, direkt mikroinjektálás, génpuska

Virális módszer: retrovirális géntranszfer

Mi a biokémiai módszerek közül általában lipid mediált módszert alkalmazunk PEI (polietilénimin)-oldat használatával. A PEI transzfekció megfelelő hatásfokú letapadó sejtek esetén, rutinszerűen alkalmazzuk fehérjetermeltetéshez szükséges plazmidok bejuttatásához és az ún. kotranszfekciós “riporter esszé” típusú kísérleteknél.

Szükséges anyagok, eszközök:

  • steril lamináris fülke
  • T293 sejtek (humán embrionális vese sejt)
  • 6 lyukú sejjtenyésztő plate
  • 10 % FBS tartalmú DMEM médium (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
  • 1% FBS tartalmú médium
  • plazmidok (VDR-1, β-gal)
  • szűrt, 150 mM NaCl oldat
  • PEI oldat
  • szerológiai pipetták, pipettor
  • automata pipetták, pipettahegyek
  • eppendorf csövek

A transzfekciót megelőző nap elvégzett műveletek:

  1. “PLATELÉS”: Sejteket tettünk 6-lyukú plate-re. 1 lyukba 300 000 sejtet tettünk 2ml médiumban (10% FBS tartalmú DMEM)
    (A sejtek platelése a passzálás főbb lépéseivel egyeznek meg: a sejtekről leszívjuk a médiumot 2. 2-3ml PBS-sel mossuk őket 3. 1-2ml tripszin-EDTA-val leválasztjuk a flaska aljáról a sejteket 4. a tripszin mennyiségének minimum 2-szeresének megfelelő 10%FBS DMEM-mel leállítjuk a tripszint 5. Bürker-kamra segítéségével megszámoljuk a sejteket 6. a kívánt sejtszámot megfelelő mennyiségű friss médiummal kimérjük)
  2. 16-18 órán keresztül inkubáljuk a sejteket a transzfekciót megelőzően, mialatt letapadnak és log fázisba kerülnek.

TRANSZFEKCIÓ:

6 lyukú plate 1 lyukára számolva a DNS-PEI mix összetétele az alábbiak szerint alakul:

DNS-mix PEI-mix Összmennyiség(DNS-PEI mix) (µl)
DNS (µg) Kiegészítve NaCl-al  (µl-re) PEI (µl) Kiegészítve NaCl-al  (µl-re)
3 100 6 100 200

Az alábbiak szerint fogjuk a plazmidokat transzfektálni lyukanként:

  1.     Transzfekció előtt 1 órával cserélje le a sejteken a médiumot 1ml 1% FBS tartalmú médiumra! (éheztetés)
  2.     Számolja ki a plazmidok koncentrációja alapján, hogy hány μl plazmidra és NaCl-ra van szükség lyukanként!

Mindkét plazmid 1µg/µl-es tehát:

plazmid NaCl
1.      lyuk 3µl VDR-1 97µl
2. lyuk 1,5µl VDR-1 + 1,5µl β-gal 97µl
3. lyuk 3µl β-gal 97µl
  1. Pipettázzon 3 eppendorf csőbe 97-97µl NaCl oldatot és ehhez pipettázza hozzá a megfelelő plazmidot a megfelelő térfogatban!
  2. A 6 lyukú plate 3 lyukára számolva pipettázzon egy eppendorf csőbe 18μl PEI-oldatot és 282μl NaCl oldatot! Rázza össze!
  3. A DNS-NaCl mixekre pipettázzon 100μl-t a PEI-mixből lassan cseppenként adagolva! Rázza össze őket!
  4. Inkubálja a DNS-PEI mixet 20 percig szobahőmérsékleten!
  5. Pipettázza a sejtekre a DNS-PEI mixet lassan cseppenként adagolva!Slide1
  6. Inkubálja a sejteket 5-6 órát 37°C-on, 5% CO2 tartalom mellett!
  7. Adjon a sejtekhez 1ml 10%FBS tartalmú médiumot!
  8. Inkubálja a sejteket 36 órát 37°C-on, 5% CO2 tartalom mellett!
  9. beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekcót követően (köv. alfejezet)

Oldatok összetétele:

  • 1% FBS tartalmú médium (50ml-hez):
  • 50ml üres DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium)
  • 0,5ml szűrt, hő kezelt FBS (Fetal Bovine Serum)
  • 0,5ml L-glutamin
  • 0,5ml penicillin-streptomycin
  • PEI-oldat:
  • 4,5 mg PEI 10ml MQ vízben feloldva
  • 6,5-7,5 közöttire kell beállítani a pH-ját
  • 0,2μm-es szűrőn át kell szűrni

Jegyzetek:

A VDR-1 és bGal plazmidokat gyakran használjuk kotranszfekciós esszékben. A bGal egy transzfekciós normalizáló plazmid, minden egyes sejttenyésztő lyukra normalizálható vele a transzfekciós hatékonyság (mix és sejtszám-függő) – a plazmid által kódolt b-galaktozidáz enzim aktivitásának mérésével. A VDR-1 úgynevezett “puffer plazmid”, ha eltérő mennyiségben használunk bizonyos plazmidokat egy-egy lyukban, VDR-1-gyel egészítjük ki hogy minden kondícióban a totál transzfektált DNS mennyiség azonos legyen.

A beta-galaktozidáz enzim aktivitásának mérése:

“beta-galaktozidáz enzimaktivitás mérése transzfekcót követően” c. alfejezetben!

 

Domén szerkezetek meghatározása a SMART adatbázis segítségével

In molecular biology on November 3, 2014 at 6:33 pm

Mi is az a SMART?

A SMART ( Simple Modular Architecture Research Tool) egy biológiai adatbázis, amit fehérje domének, fehérje szekvenciákon belüli azonosítására és szerkezeti analízisére használunk. Használatával több mint 500 domén család tagját azonosíthatjuk melyek a jelátviteli, az extracelluláris és a kromatin-asszociált fehérjék közé tartoznak. Ezek a domének széles körben annotáltak, a fejlődésitani szempontból, a funkcionális alosztály, a harmadlagos szerkezet és a működés szempontjából fontos oldalláncok tekintetében. Minden domén információja egy nem-redundáns fehérje adatbázisban található, továbbá egy kapcsolódó adatbázis rendszer tárolja a keresési paramétereket és a rendszertani információkat.

Jelen tutoriálban az aktuális (2014) működési módjáról adunk egy áttekintést ami előreláthatólag változni fog.

A SMART-ot két különböző módban használhatod: normál és genomikai módban.

A fő különbség közöttük az alárendelt protein adatbázis használatában van.

  • A normál SMART-ban, az adatbázis a Swiss-Prot, SP-TrEMBL és a stabil Ensembl proteomokat tartalmazza.
  • A genomikai SMART-ban, csak a teljesen szekvenált genomok proteomjai használhatóak, Ensembl a metazoákhoz és a Swiss-Prot a maradékhoz.

A protein adatbázis a normál SMART-ban jelentős redundanciával (létszámfölösleggel) rendelkezik, annak ellenére, hogy az azonos fehérjéket eltávolították. Ha arra használod a SMART-ot, hogy domén szerkezeteket deríts fel, vagy meg akarod találni a különböző genomokban a pontos domén számot, fontold meg, hogy Genom módba váltasz.

Az adatbázist az Európai Molekuláris Biológiai Laboratórium (EMBL) kezeli Heidelbergben. Az EMBL egy molekuláris biológiai kutatóintézet, amit 20 európai ország és Ausztrália, mint társult tagállam támogat. Az EMBL 1974-ben jött létre, mint egy kormányközi szervezet, amit a tagországok állami kutatási pénzből tartanak fent. A kutatást az EMBL-ben körülbelül 85 független csoport végzi, átfedve a molekuláris biológia spektrumát. A Laboratórium 5 helyen működik: a fő laboratórium Heidelbergben van, a távoli állomásai Hinxtonban (az Európai Bioinformatikai Intézet (EBI)), Grenoble-ban, Hamburgban, és a Róma közelében fekvő Monterotondoban van.

Magyarország 2014-ben csatlakozott az EMBL-hez!!!

Mindegyik helyszín specifikus kutatási területtel rendelkezik. Az EBI a bioinformatikai kutatások és szolgáltatások fejlesztésének és nagyszámú adatbázis fenntartásának a központja, amelyek díjmentesen hozzáférhetőek a tudományos közösség számára. Grenoble-ban és Hamburgban a kutatás a szerkezeti biológiára összpontosít. Az EMBL kiemelt Egér Biológiai Egysége Monterotondoban található. A székhelyen, Heidelbergben, Sejtbiológiai és Biofizikai, Fejlődésbiológiai, Genom Biológiai és Szerkezeti és Számítógépes Biológiai egységek vannak, valamint szolgáltatói csoportok egészítik ki az előbb említett kutatási területeket.

SMART használata

A következőekben végigmegyünk egy domén szerkezet meghatározásának folyamatán. Azonban azt itt meg kell említeni, hogy nem rögtön a SMART felületen kezdjük. Első lépésként az UniProt adatbázis segítségével kikeressük a megfelelő, meghatározni kívánt domén kódját. Az UniProt a következő linken érhető el: http://www.uniprot.org/. A linkre kattintva megjelenik a főoldal.

Az oldal a következőképpen néz ki:

1

A UniProt egy átfogó, magas színvonalú és szabadon hozzáférhető adatbázisa a fehérje szekvenciáknak és a funkcionális információknak, sok bejegyzés a genom szekvenálási projektekből származik. Nagy mennyiségű információt tartalmaz a szakirodalomból származó fehérjék biológiai funkcióiról.

A UniProt az Európai Bioinformatikai Intézet (European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)), a Svájci Bioinformatika Intézet (Swiss Institute of Bioinformatics (SIB)), és a Protein Információ Forrás (Protein Information Resource (PIR)) közötti együttműködésként jött létre. A három intézményen keresztül, több mint 100 ember vesz részt különböző feladatokban, mint az adatbázis kezelésben, szoftverfejlesztésben és támogatásban.

Az EMBL-EBI-t és a SIB-et a Swiss-Prot és TrEMBL készítéséhez használták, míg a PIR a Protein Szekvencia Adatbázist (PIR-PSD) hozta létre. A TrEMBL (Translated EMBL Nucleotide Sequence Data Library) eredetileg azért jött létre, mert a szekvencia adatok olyan ütemben generálódtak, hogy a Swiss-Prot nem tudott vele lépést tartani. Eközben a PIR fenntartotta a PIR-PSD-t és a kapcsolódó adatbázisokat, köztük az iProClass-t, ami egy fehérje szekvencia adatbázis. 2002-ben a három intézmény úgy döntött, hogy egyesíti erőforrásait és szakértelmét és megalakítja az UniProt konzorciumot, melynek élén Rolf Apweiler, Alex Bateman, Cathy Wu és Ioannis Xenarios állnak.

A UniProt adatbázisok: a UniProt Knowledgebase (UniProtKB→ protein tudásbázis) , a UniProt Reference Clusters (UniRef→ szekvencia csoportok), és a UniProt Archive (UniParc→szekvenciák archívuma). A UniProt Metagenomic and Environmental Sequences (UniMES) adatbázis egy gyűjtemény, mely kifejezetten a metagenomikai és környezeti adatok számára lett kifejlesztve.

Attól függően, hogy mit szeretnél keresni, kiválaszthatod a legmegfelelőbb adatbázist:

2

Ez esetben, példaként tehát, az 1-es típusú ösztrogén receptor (ESR1) doménszerkezetét nézzük meg.
A UniProtKB-t kiválasztva, a keresőbe beírtam, hogy ESR1 (ösztrogén receptor 1). Majd a keresés gombra kattintottam, és a következőt kaptam:

3

Ahogy a piros nyíl is mutatja, a Homo sapiens (Human) ESR1-re kattintottam, mivel ennek a szerkezetét szeretném meghatározni. Így a következő oldalra jutottam:

4

A feljövő ablakban, az ESR1 funkciójáról, lokalizációjáról, egyéb elnevezéséről, mutációiról, expressziójáról, interakcióiról, stb. kaphatunk információt. De ahhoz, hogy mi a SMART-ban a doménszerkezetét láthassuk, a neve mellett lévő, bekarikázott kódot át kell, hogy másoljuk annak keresőjébe. Az alábbi linken érhető el a SMART főoldala:
http://smart.embl-heidelberg.de/

5

A találatok az alábbiak voltak, de a pirossal bekarikázottat választottam:

6

Megkaptam a doménszerkezetet! 🙂

7

A kapott szerkezetet a Zoom in/out gombra kattintva nagyíthatjuk/kicsinyíthetjük. Továbbá beállítható az intronok pozícióinak feltüntetése.

Az egyes doménekre rákattintva, részletes információkat kaphatunk azokról. Így példánk esetében megtudtam, hogy az ESR1, két, alacsony komplexitású régióval, egy C4 cink-ujj doménnel (ZnF_C4), és egy, a hormon receptorokra jellemző ligand-kötő doménnel (HOLI) rendelkezik.

8

9

A doménekről általában

A protein domén az adott protein szekvenciának egy konzervált része és a szerkezete (tercier) képes függetlenül fejlődni, funkcionálni és létezni a fehérje lánc többi részétől. Mindegyik domén egy kompakt 3D-s szerkezetet alkot, és gyakran egymástól függetlenül lehetnek stabilak és hajtogatottak. Számos fehérje különböző szerkezetű doméneket tartalmaz. Egy adott domén különböző fehérjében is megjelenhet. A molekuláris evolúció a doméneket, mint építőelemeket használja, melyeket különböző elrendezésben rekombinál, hogy különböző funkciójú fehérjéket hozzon létre. A domének hossza változó, körülbelül 25 aminosav hosszúságtól, legfeljebb 500 aminosav hosszúságig terjedhetnek. A legrövidebb doméneket, mint a cink-ujj fehérjéket, fémionok vagy biszulfid hidak stabilizálják. A domének gyakran funkcionális egységet alkotnak, mint például a kalmodulin kalcium-kötő EF-hand doménje. Mivel egymástól függetlenül stabilak, géntechnológiával a domének kicserélhetőek az egyes proteinek között, kiméra fehérjéket eredményezve.

Például az ESR1 domén szerkezete:

10

Kék színnel a DNS kötő domén (azaz a C4 cink-ujj domén), míg zöld színnel a ligand kötő domén (HOLI) látható.

A cink-ujj fehérjék

A cink-ujj (Znf) domének viszonylag kis fehérje motívumok, melyek összetett ujj-szerű kiemelkedéseket tartalmaznak, amik tandem kapcsolatokat létesítenek a célmolekuláikkal. Néhány ilyen domén képes cinket kötni, de sokan közülük nem, azok helyette fémet (mint például vasat), vagy pedig nem-fémet kötnek. Például, néhány családtag só hidakat hoz létre, hogy stabilizálja az ujj-szerű redőket. Először, mint DNS-kötő motívumot azonosították őket a Xenopus laevis (Afrikai karmos béka) TFIIIA transzkripciós faktorában, azonban mára felismerték, hogy DNS-hez, RNS-hez, fehérjékhez és/vagy lipid szubsztrátokhoz is képesek kötődni. A Znf domének gyakran klaszterekben találhatóak, ahol az ujjak különböző kötési sajátságokkal rendelkeznek. Jelentős sokoldalúságot mutatnak a kötési módokban, akár az azonos osztályba tartozó tagok között (pl.: néhányan DNS-hez, mások fehérjékhez kötődnek), ami arra utal, hogy a Znf motívumok stabil scaffold-ok (állványok), amik kialakított specializált funkciókkal bírnak. Például, hogy néhányat említsek, a Znf-t tartalmazó fehérjék a gén transzkripcióban, a transzlációban, az RNS-forgalomban, a citoszkeleton-szerveződésben, az epitheliális fejlődésben, a sejt adhézióban, a fehérje összetekerésben, a kromatin átalakításban és a cink-érzékelésben vesznek részt. A cink-kötő motívumok stabil struktúrák, amik ritkán ugyan, de konformáció változáson eshetnek át a célmolekulához történő kötődést követően.

A cink-ujj fehérjékről szóló videót lásd az alábbi linken:
https://www.youtube.com/watch?v=WyU2v7HT6bw

HOLI (hormon receptorok ligand-kötő doménje)

A szteroid vagy nukleáris hormon receptorok transzkripciós szabályozók fontos szupercsaládját alkotják, amik igen sokféle élettani funkcióban vesznek részt, beleértve az embrionális fejlődés szabályozását, a sejt differenciálódást és a homeosztázist. A receptorok a sejtmagban dimer molekulákként funkcionálnak, hogy ligand érzékeny módon szabályozzák a célgének transzkripcióját.

A nukleáris hormon receptorok nagymértékben konzervált DNS-kötő domént tartalmaznak, ami felismeri a specifikus szekvenciákat, s a C-terminális ligand-kötő doménhez egy linker régión keresztül kapcsolódik. Továbbá, bizonyos nukleáris hormon receptorok N-terminális moduláló doménnel rendelkeznek.

A ligand-kötő domén ligand kötődésre válaszol, vagyis a receptor konformációs változását idézi elő, kialakítva ezzel a választ. Így molekuláris kapcsolóként hatva bekapcsolja a transzkripciós aktivitást. A ligand-kötő domén egy olyan rugalmas egység, ahol a ligand bekötődése stabilizálja annak konformációját, ami viszont kedvez a koaktovátor bekötődésnek, módosítva a receptor aktivitását. A koaktivátor a ligand-kötő domén C-terminális végégnek AF2 helyéhez kötődik be. Tehát a ligand bekötődése a ligand-kötő domén konformációját megváltoztatja, ami viszont kihat a DNS-kötő domén DNS-kötő specificitására.

A hormonhatás mechanizmusa:
https://www.youtube.com/watch?v=TgNwxF3aQpE

Az alábbi linkre kattintva többet tudhatsz meg az ESR1-ről, illetve az ESR2-ről, de ez utóbbit példánkban nem említettük:
http://en.wikipedia.org/wiki/Estrogen_receptor

Az ösztrogén hatásmechanizmusáról szóló videó az alábbi linket érhető el:
https://www.youtube.com/watch?v=JQcFk7J_Tf4

Visszatérve a példánkhoz…

A szerkezeti ábra alatt található részben összegzik a receptorról meglévő adatokat. Öt fülön belül keresgélhetünk tovább:

11

Például, megnézhetjük, hogy mikkel áll kapcsolatban az ESR1:

12

Az ismert és a feltételezett kölcsönhatások a STRING adatbázisból érhetőek el:
http://string-db.org/

Sikeres keresgetést!  🙂

Flóra

A NanoDrop használata nukleinsav mérésre.

In molecular biology on February 17, 2014 at 10:33 am

Bevezetés:

A spektrofotometria az egyik legelterjedtebb anyagvizsgálati módszer. Az igen sokféle mérési technika közös alapja az, hogy az anyagok molekuláris,- atomi szintű energia átmenetei kvantáltak és ezek az energiaszintek jellemzőek az adott anyagra. Az egyes energia-átmenetekhez meghatározott hullámhosszak (elnyelt vagy kibocsátott) tartoznak a E=hν=hc/λ összefüggés alapján. Ha megvizsgáljuk egy gerjesztett állapotban levő anyag sugárzásának, a hullámhossz szerinti eloszlását (spektrumát), abból következtethetünk részben az anyagi minőségre, részben az anyagmennyiségre, sőt némely esetben a molekula-szerkezetre is. Ezt emissziós színképelemzésnek nevezzük. Ugyanez a cél az abszorpciós fotometriában, itt egy alapállapotú anyagot világítunk át valamilyen folytonos sugárzással és az átbocsátott/elnyelt sugárzást elemezzük. Legegyszerűbbek és legelterjedtebbek a látható fénnyel történő mérések, de a szerves molekulák vizsgálatára az infravörös tartományba eső rezgési színképeket használják.

Az anyagok spektroszkópia szempontjából fontos tulajdonsága a szín, amely szoros összefüggésben van molekula-szerkezetükkel. Sznesnek akkor nevezünk egy anyagot, ha a ráeső fényből szelektíven abszorbeál, vagy szelektíven ver vissza. Ha pl. valamely anyag a fehér fényből a vöröset nyeli el, akkor a többi spektrum szín keverékét, vagyis a zöldet engedi át vagy veri vissza. Lehetséges az is, hogy az anyag az ultraibolya vagy az infravörös tartományban abszorbeál, ezt szemünk nem érzékeli, az ilyen anyagokat színtelennek látjuk.

A nukleinsavak mennyiségi meghatározásához leggyakrabban a 260 nm-en mért elnyelési értéket szokták figyelembe venni. Ez a legegyszerűbb, leggyorsabb és legelterjedtebb módszer az RNS és DNS tartalom megállapítására. A tiszta nukleinsavak jellegzetes elnyelési profilt mutatnak 230 és 320 nm között. 320 nm-nél a tiszta nukleinsav-mintának nincs már elnyelése. A normális görbétől való eltérés szennyezők jelenlétére utal. Az elnyelés egyenesen arányos a minta RNS vagy DNS tartalmával. A nukleinsavak abszorpciós maximuma 260 nm-nél látható. Az elnyelés mértékéből a koncentráció a következő egyenlet alapján számítható:

μg (RNS) / ml = A260 × hígítás × 40,

ahol

A260 = elnyelés (abszorpció, optikai denzitás) 260 nm-nél (OD260)

hígítás = a hígítás mértéke, pl. tízszeres hígításnál 10

40 = az RNS átlagos extinkciós koefficiense (40 μg / OD260).

A pontos érték függ a pH-tól, illetve közvetett módon az azt befolyásoló tényezőktől. A kettős szálú DNS koncentrációja hasonlóan számolható (50 μg / OD260), de mivel a timin és az uracil extinkciós koefficiense különbözik, a DNS-szennyezett RNS-oldat, ill. az RNS-szennyezett DNS-kivonat elnyeléséből helytelen adat számolható.

A spektrofotometriára manapság leggyakrabban használt eszköz a NanoDrop. Amelyek nagy előnye, hogy nem küvettában, hanem két száloptika között mágnes segítségével kifeszített egyetlen cseppben mérik egy adott oldat elnyelési tulajdonságait. 0,5-3 μl minta elegendő a méréshez, ami nem elhanyagolható előny egy 20-60 μl végtérfogatú nukleinsav-kivonat esetén. A készülék a mérés után a 220 és 350 nm közötti spektrumot is kirajzolja, ill. a helyes beállítás mellett ng/μl mértékegységgel azonnal kijelzi a minta nukleinsav-tartalmát is.

ND2

Használat

Előkészítés

A munka megkezdése előtt fontos a munkavégzéshez szükséges anyagok s eszközök odakészítése. A mérés során 10 μl-es pipettára, 10 μl-es pipetta hegyre, NFW-re (nuclease free water), kis papírtörlőre, s persze magára a mintára lesz szükségünk. A NanoDrop, s a hozzá kapcsolódó számítógép kizárólag gumikesztyűben használható!

Program indítása

A számítógép asztalán a NanoDrop 1000 ikonra kattintva indítjuk el a programot. Ekkor a következő ablak jelenik meg, ahol a felhasználó illetve a mérni kívánt anyag állítható be. DNS/RNS mérése esetén a Nucleic Acid menüpontot válasszuk ki.

ND4

Kezelőfelület, használat

A megjelenő ablak jobb felső sarkában (Sample type) állítható be a mérni kívánt nukleinsav. Alatta adható meg a minta „neve” (Sample ID). Nagyon fontos, hogy ez egy olyan kód legyen, mely tartalmazza a mérést végző személy nevét, a mérés dátumát, s a minta azonosítóját.  A következő sorban a mérések sorszáma látható, ez automatikusan sorszámozza a méréseket. Az ablak jobb alsó sarkában a minta nukleinsav tartalma látható ng/μl mértékegységben.

ND5

A program indításakor az inicializáláshoz 1-5 μl NFW-t pipettázunk a minta felviteli felületre, ráhajtjuk a kart majd az OK-ra kattintunk, a folyamat indításához. Utána kis papírral mindkét felületet alaposan megtöröljük. Ezt követően további mosásokat végzünk. Továbbra is 1-5 μl NFW-t viszünk fel (vagy olyan oldatot, amelyben a nukleinsav fel van véve, pl. különböző DNS-tisztító kitek esetén bizonyos sóoldatok), majd „Blank-ra” kattintva végezzük a nullázást (háttérfelvétel). Ezt követően már mérhetjük a mintáinkat, melyből 1-2 μl-t használunk. Figyeljünk a név beállítására, s a minták közt alaposan töröljük meg a felületet.

ND3

Ha végeztünk a mintákkal, eredményeinket megtekinthetjük a „Show-report-ra” kattintva, továbbá kinyomtathatjuk a „Print-report” segítségével.

ND6

Minőségellenőrzés:

Érdemes az eredményeink elemzésénél ellenőrizni az OD 260/280 és OD 260/230 arányt, melynek a nukleinsav minták minőségi mutatói. A következőket érdemes tudni ezen számarányokról:

– A 260/280 arány protein, fenol vagy egyéb, 280 nm-en abszorbeáló szennyeződés jelenltére utal: RNS esetén 2.0, DNS esetén 1.8 tekintehtő teljesen tisztának.

– A 260/230 arány elsősorban partikuláris szennyeződésekre utal: általában mind DNS, mind RNS esetén magasabb, mint a 260/280 arány, általánosan 1.8-2.2 között mozog. Ha ennél alacsonyabb, az jelzi a kontaminációt.

Ezt követően a kikapcsolás előtt, 3x mossuk a gépet, megkönnyítve ezzel azon kollegánk (vagy épp a magunk) dolgát, aki utánunk következik. Épp ezért ne felejtsük ezt el! Végezetül a jobb felső sarokban lévő „Exit-re” kattintva léphetünk ki a programból.

 

A leírást Pataki Zoltán készítette.

Lektorálta: Ozgyin Lilla.

Gélelektroforézis

In molecular biology on October 27, 2013 at 2:14 pm

Az elektroforézis elvi alapjai

Töltéssel rendelkező részecskék elektromos térben töltésüknek megfelelő irányban mozognak. A pozitív töltésű kationok a negatív katód, míg a negatív töltésű anionok a pozitív anód felé haladnak. Az elektródok felületéhez érve az ionok töltésüket elvesztik.  Elválasztástechnikai szempontból az ionok áramlása, az ún. elektroforézis a lényeges, az ionok semlegesítődése az elektrolízis másodlagos kísérőfolyamatnak tekinthető.

Az ionok vándorlási sebességét töltéssűrűségük és az alkalmazott feszültség-gradiens nagysága szabja meg. A feszültség-gradiens egyenesen arányos a két elektród közötti feszültségkülönbséggel és fordítottan arányos az elektródok távolságával.  Az ionok töltéssűrűsége egyenesen arányos a nettó- töltéssel  és fordítva arányos a mérettel.

Az ionok eltérő töltéssűrűségük miatt eltérő sebességgel mozognak az elektromos térben, ami lehetővé teszi elválasztásukat. A töltéssel rendelkező ionok kialakulásának mértéke a közeg pH-jától függ.

Mindez lényegében azt jelenti, hogy minél kisebb egy ion tömege/mérete, annál gyorsabban tesz meg hosszabb távot a gélen, míg a nehezebb hosszabb idő alatt rövidebbet.

A katódon H2, az anódon O2 gáz keletkezik.

Az elektroforézisnek több típusa alakult ki a tudomány fejlődésével: szabad-határfelületű elektroforézis, zóna elektroforézis (hordozóval végzett), és végül az agaróz gél elektroforézis.

 

Agaróz gél elektroforézis

 

Az agaróz gélelektroforézis elsősorban nukleinsavak analízisére alkalmas módszer, egyéb kísérletes reakciók sikerességének ellenőrzésére szolgál: PCR, restrikció, szonikálás, DNS- és RNS-tisztítás. A nukleinsavak elválasztása elektromos erőtérben, hálózatos gélmátrixban, megfelelő nukleinsav referencia „létra” jelenlétében történik, detektálása fluoreszcens nukleinsav-festékkel történik.

 

GeneRuler_DNA_Ladder_1

A Thermo Scientific cég forgalomban lévő néhány “GeneRuler” létra

Az agaróz lineáris poliszacharid, melyet tengeri algából nyernek. Az alacsony olvadáspontú agaróz egészen kis DNS darabkák (50-500 bázispár) elválasztására is alkalmas, azonban az agaróz géleket általában nagyobb méretű molekulák szeparálására használjuk. A DNS vándorlási sebességét az agaróz gélben számos tényező befolyásolja. A DNS neutrális pH mellett negatív töltésű és az anód felé mozog. A nagyobb DNS darabok lassabban, a kisebbek gyorsabban mozognak a molekulaszűrő hatás miatt.

Ám a mérete mellett alakja is módosítja a vándorlás sebességét; a szuperhelikális, cirkuláris és lineáris DNS mozgékonysága az elektroforézis körülményeitől függő módon eltérő.

A gélben lévő DNS-t ethidium-bromiddal festik. A festék molekulái beékelődnek a DNS bázispárjai közé. A festék UV fényben láthatóvá válik, mivel 550 nm-en vöröses narancsszínű fluoreszcens fényt bocsát ki. A DNS festést legtöbbször az elválasztás után végzik, azonban meggyorsítható a detektálás úgy is, hogy az ethidium-bromidot már a gél készítésekor belekeverjük a gél anyagába. Az ethidium-bromid karcinogén, a vele való munka és a feleslegessé váló hulladék megsemmisítése nagy körültekintést igényel!

Ezért a laborban leginkább GelRed-et használunk DNS festésre, a gélhez a készítése során adjuk hozzá.

Agaróz gél készítése és öntése

 Gél készítése:

Általában 1%-os gélt szoktunk készíteni és önteni. Ez persze a végezni kívánt kísérlettől függ, ha a vizsgált nukleinsav rövid akkor töményebb, ha hosszabb akkor hígabb géllel kell dolgoznunk.

Kis futtatókáddal dolgozunk melybe mintafelvivő fésűt helyeztünk. Táramérlegen bemérünk 0,7 g agarózt, ezt beleszórjuk borszilikát üvegbe és ezt felöntjük 70 ml 1x TAE pufferrel. Ezt az elegyet mikrohullámú sütőben felmelegítjük annyira, hogy egy vízszerű, áttetsző agaróz szemcséket nem tartalmazó szirupszerű folyadékot kapjunk. Mindezt gyakori rázogatással érhetjük el gumi védőfogóval tartva az üveget hiszen nagyon forró. Az üveg kupakja végig rajta kell legyen meglazítva. Amikor kész ez az oldat akkor visszahűtjük az üveget kézmelegre és 1000x GelRed dsDNS (duplaszálú DNS) festéket adunk az agarózhoz. Az elegyet a kádba öntjük és az esetlegesen képződő buborékokat egy pipetta hegyének segítségével megsemmisítjük, ugyanis ha benne marad és úgy szilárdul meg az hibát okozhat a minta futásában.

Miután megszilárdult a gél a kádat 1x TAE pufferrel töltjük fel úgy, hogy fél cm-re ellepje a gélünket.

 Mintafelvitel:

Ált. 200-500 ng DNS már szép, látható jelet ad. Leggyakrabban Xylén-Cyanol loading dye segítségével tesszük láthatóvá a mintáink futását.

Az egyik vagy mindkét szélső zsebbe DNS létrát töltünk, majd sorban a mintáinkat. Gyorsan kell dolgoznunk, hogy ne diffundáljanak szét.

 Futtatás:

Ez a művelet úgy történik, hogy mivel tudjuk, hogy a DNS töltése negatív és ezért a pozitív irányba fog futni, ezért ennek megfelelő elrendezésben fedjük le az elektromos csatlakozókat tartalmazó fedővel a kádat és azokat csatlakoztatjuk is hozzá illetve a tápegységhez. A feszültség, futtatási idő változtatható a mintánk függvényében.

electrophoresis cr vs

 Elektroforetikus berendezés

   A gél vizsgálata:

A DNS sávok detektálása UV átvilágító asztalon történik védőálarcban. A gélt az átvilágító lapra kell helyezni és rázárni a fedelet. Az UV fényben láthatóvá válnak a gélben lévő

DNS sávok. Ezek helyzete és intenzitása felvilágosítást ad a minta tisztaságáról. Ha a várt sávok mellett további sávok is láthatók akkor az szennyezettségre utal. A plusz sávok mennyisége a szennyezettség mértékével arányos. Lehet degradáció miatt, RNS szennyezettség miatt, minta szétfutása miatt stb.

gel_0_0

 Fluoreszcensen jelzett DNS UV fényben

Az alábbi videóban megnézheted az elektroforézis folyamatát:

http://www.youtube.com/watch?v=ztKgyIqqA4U

 Sok sikert!

 Andi és Flóra

 

Sejtszámolás

In molecular biology on October 9, 2013 at 2:08 pm

A számolás lényege, hogy a sejtszuszpenzióból (az az oldat, amiben a sejtek a lehető legegyenletesebben vannak eloszlatva) egy kis mintát veszünk, abban meghatározzuk a sejtszámot, és az így kapott értékből következtetünk a teljes mennyiségre. A meghatározáshoz – a mikroszkóp mellett – egy segédeszközt használunk, ez a Bürker-kamra.

Bürker-kamra felépítése:

Ez egy vastagabb üveglemezből és egy vékony fedőlemezből áll. A vastag lemezre finom beosztás van karcolva. A kamra olyan, hogy ha a fedőlemezt a vastag lemezre helyezzük és azt leszorítjuk, akkor pontosan 0,1 mm vastag rés marad közöttük. A vizsgálandó anyagot ebbe a résbe helyezzük be a fedőlemez felhelyezése után úgy, hogy a vastag lemezbe vésett H alakú mélyedés szárai között található négyzetnél a fedőlemez széléhez cseppentjük. Mivel tudjuk a rés vastagságát és a vastag üveglemezen levő beosztások távolságát, a beosztások és a fedőlemez által határolt bármelyik téglatest térfogatát meg tudjuk határozni, így meg tudjuk adni a térfogategységben található sejtek számát.

 burker2

Taktikai segítség:

A számolást általában a bal felső sarokban 3 vonallal körülhatárolt négyzetben érdemes kezdeni. Ezt a lentebb látható képen kék négyzetek mutatják. A három vonal közzül azokat a sejteket számoljuk bele amelyek a középső vonalon vannak. Annak elkerülése érdekébe, hogy belezavarodjuk melyik sejtet is számoltuk, érdemes úgy csinálni, hogy azokat a sejteket is beleszámoljuk  amelyek a három vonallal körülhatárolt négyzetben felül és jobb oldalon középső vonalon vannak.A sejtek számolását balról jobbra végezzük. Általában 3 ilyen három vonallal határolt négyzetben határozhatjuk meg sejtek számát és ezeket átlagolva következtethetünk a teljes mennyiségre.

Burker3

Jó munkát! 🙂

Dóri és Niki

qPCR primertervezés egyszerűen

In molecular biology on September 5, 2013 at 5:17 pm

Kvantitatív PCR alapok

A qPCR technika (Real-Time, azaz valós idejű, kvantitatív) a nukleinsavak (DNS vagy cDNS) relatív/abszolút mennyiségi meghatározásának ún. “gold standard”-je. Alapelve nem különbözik a hagyományos, végpontos PCR-től, azonban van egy alapvető különbség: a fluoreszcens festékek használata. Ezek segítségével valós időben, a PCR ciklusok során, valós időben detektálható az aktuális DNS mennyiség az akkumulálódó fluoreszcens jel által. A fluoreszcens festékek közül elsősorban a SyBrGreen-t alkalmazzák, amely interkalálódik, így minden duplaszálú DNS-hez kötődik, ezáltal mind a primer dimerek, mind az aspecifikus amplikonokat kimutatja. Ezzel szemben a szekvencia-specifikus próbák, mint a “molekuláris fáklya” (Molecular Beacon), Skorpió és TaqMan hidrolízis próbák a két PCR primer közötti szekvenciához kötődve csakis a célszekvencia amplifikációját jelzik.

Kísérleti céltól függően különböző módon kell PCR primereket terveznünk. Genomi DNS esetén elsődleges fontosságú annak szem előtt tartása, hogy génre végzett PCR esetén tartalmazza az intronokat, így intron-exon határra tervezett primerekkel elkerülhető, hogy RNS amplifikálódjon. RNS abszolút vagy relatív kvantitálása esetén célszerű két szélső exonra tervezni, biztosítva, hogy az intronokat tartalmazó genomi DNS ne sokszorozódjon egyszerűen amiatt, mert az áthidalandó távolság a két primerpár közt túl nagy. Mindkét esetben figyelni kell az SNP-k jelenlétére, amelyek egyes esetekben teljesen meghiúsíthatják a reakciót.

A UPL rendszer

Laboratóriunkban évek óta az úgynevezett UPL rendszert használjuk.  Az itt mért adatpontok nagy része valószínűleg qPCR mérésekből származik, így hasznos lehet áttekinteni az esszétervezés szabályait. A UPL rövidítés az “Universal Probe Library” elnevezésből származik, amely kifejezés onnan ered, hogy olyan oligo szettet forgalmaznak (Roche), amely 165 különböző fluoreszcens hidrolízis próbát tartalmaz. Ez a szett teljes mértékben lefedi az eddig szekvenált genommal rendelkező összes élőlény transzkriptjeit azáltal, hogy a transzkriptek leggyakoribb 8-mer és 9-mer motívumait gyűjtötték össze. Így ha qPCR-t tervezünk, nincs szükség manuálisan megtervezni a próbát, hanem a Roche weboldalán elérhető “Assay Design Center”-ben a megfelelő lépések sorozatát követően a kívánt transzkriptre megkapjuk mind a legoptimálisabb PCR primerpárok szekvenciáját, mind az ezekhez ajánlott UPL próba számát. A laborunk rendelkezik ezen UPL próbák közül 90-nel, amelyek a teljes humán genomot lefedik. Ezen próbák jellegzetessége, hogy elkészítésükkor az ún. LNA technikát alkalmazták, amely annyit jelent, hogy olyan nukleotid-analódokat használtak szintéziskor, amelyek kémiailag erősebben kötődnek a templátjukhoz, mint a konvencionális oligonukleotidok. Erre azért van szükség, hogy kellően magasan tarthassuk a Tm-et rövid próbák mellett is ( a UPL próbák átlagosan 8-9 nukleotid hosszúságúak). Az LNA-król bővebben a következő linkeken olvashatnak, angol nyelven: 1., 2. A UPL rendszer leírása szintén angolul: itt.

A UPL Assay Design Center használata

Az elkövetkezőkben végigmegyünk egy példán keresztül a qPCR esszétervezés folyamatán. Az esszétervezés egy egyszerű webes felületen valósítható meg, amely a Roche oldalán, az alábbi közvetlen linken érhető el: UPL Assay Design Center. A linkre kattintva egy új ablakban meg fog jelenni a tervezőközpont főoldala, ahol alapbeállításokat végezhetünk. Az oldal a következőképpen néz ki (kattintással nagyítható):

UPL1

A főoldalon 3 fő lépés olvasható:

  • válassza ki az organizmust
  • vigye be a szekvenciát (copy&paste, szekvencia név vagy adatbázis ID alapján)
  • nyomja meg a “Design” gombot

Valóban ennyire egyszerű. A szekvenciabevitelnél esetünkben az adatbázis ID-t használjuk. Az ENSEMBL egy gén alapú genomböngésző, olyan genomi információkat tartalmazó, gazdagon annotált adatbázis, amely a genetikusoknak, molekuláris biológusoknak, és általában a genommal foglalkozó kutatóknak biztosít kiváló információforrást projektjeikhez. Többek között információt kaphatunk az adott pozíciókban fellelhető SNP-kről és az adott organizmusban megtalálható transzkriptekről (különböző RNS-ek, alternatív splice variánsok, exon-intron struktúra és egyebek). Így ha az ENSEMBL segítségével terveztetünk esszét a tervezőközpontban, biztosak lehetünk benne, hogy mindenre kiterjedően történik a primerek kiválasztása. A genomböngésző főoldala a következő linken érhető el: ENSEMBL.

Az ENSEMBL oldalán első lépésként bal oldalon ikonokon keresztül, vagy legördülő menüből ki kell választani azt a fajt, amelyből qPCR-t tervezünk, ezt követően egy új oldalon megjelenik a génspecifikus keresési felület. Esetünkben az egér IL-6 génre tervezünk qPCR esszét (kattintással nagyítható):

UPL1

upl4

A “Go”-ra kattintva megjelenik az adott génre  többféle tulajdonság. Ezek közül a “Gene”-re kattintunk:

UPL4

A linkre kattintva több eredményt is kaphatunk. A leírásukból megállapíthatő, hogy csak az első(néhány) a keresett gén, a többinek csak valamilyen biológiai kapcsolata van a sejtben a választott géntermékkel. Esetünkben a második találat az IL-6 receptorának génje.  Az első találatot választjuk, rákattintva a Gene ID-ra:

upl2

Ennek következtében a következő oldalra jutunk, amelyen a gén különböző tulajdonságait találjuk, az alternatív transzkriptekkel együtt, amelyek egy táblázat formájában jelennek meg. Ezeket egyenként megtekintve kiválasztható, hogy melyikre érdemes az esszét tervezni. Például lehetséges, hogy egyes transzkriptek “bizonytalanok”- van, amelyik nem íródik át fehérjévé, van, amelyik korán lebomlik és szintén nem eredményez fehérjét. Más esetben a kódoló szekvencia nem teljes. Minden esetben a bejegyzéseket egyenként kell ellenőrizni, így megtudhatjuk, melyik szakasz az, amely pl minden teljes értékű splice variánsban benne van. Esetünkben egy transzkript van: ENSMUST00000026845.

upl1

Térjünk vissza a UPL oldalára: UPL Assay Design Center.

A főoldalon válasszuk ki az organizmust (egér), majd a megjelenő oldalon másoljuk be a talált ENSEMBL azonosító(ka)t – ha többet is választottunk, akkor azokat vesszővel elválasztva írjuk be a boxba –  majd válasszuk ki az “intron spanning assay”-t alul, hogy a genomi DNS ne zavarjon be a reakcióba:

upl6

A lap alján található “Design” gombra kattintva a szoftver újra rákérdez, hogy milyen transzkriptekre tervezünk. Az előzőeket bejelölve rákattintunk ismét a “Design” gombra. A következő eredményt kapjuk:

upl5

A program kiad egy-egy primerszekvenciát és az ajánlott UPL próba számát (#6). Az alsó összefoglaló ábrán látható a két primer és a próba elhelyezkedése az RNS-en belük, valamint jelölve vannak a SNP-ek. A “PDF report gomb megnyomásával PDF formátumban letölthető a tervezett esszé.

A következő, minőségi kontroll lépés az esszé ellenőrzése az UCSC Genome Browser-en (e-PCR). Ez a genomböngésző alkalmas (sok más mellett) arra, hogy megnézhessük az adott génen a primerek orientációját, hogx valóban intron-átérő-e (intron-spanning) stb. A UCSC e-PCR oldala a következő linken elérhető: UCSC in silico PCR.

upl7

A fent pirosan keretezett részt kell kitölteni, egyrészt a fajnévvel, az adott fajhoz tartozó genom “assembly”-vel ( ált. a legújabbal), targetként RNS mérés esetén a “UCSC genes”-t választjuk. A két primert is bemásoljuk és a “submit”-ra kattintva megkapjuk a szekvenciát, amit meg lehet jeleníteni: a “keletkezett” PCR terméket jelöltem piros kerettel az alábbi képen – jól látszik, hogy megfelel az elvárásainknak, megfelelő orientáltságúak a primerek és intronnal elválasztott exonokon vannak a primerek.

upl8

Ezt követően megrendelhetjük a HPLC-tisztított primereket. Célszerű 2-3 esszét tervezni azonos génre, mert tapasztalataink szerint ezek 2/3-a nem, vagy csak optimalizálás után működik jól.

Általános qPCR szabályok:

  • Az amplikon (termék) hossza a lehető legrövidebb legyen (60-70 bp ideális, de mindenképpen 100 bp alatt).
  • A primerek Tm-je 60°C körül legyenek, míg a próbáé 10°C-kkal felette.

  • Az oligo és a próba közötti távolság minimális ekell, hogy legyen, mivel a Taq polimeráz exonukleáz aktivitása így a legnagyobb.
  • Az oligok Tm-je (GC-tartalom)  a lehető legközelebb legyen egymáshoz.
  • A két primer 3′ végének utolsó 5 nukleotidjai között a GC-tartalom lehetőleg identikus legyen.
  • Olyan oligo szetteket válasszunk, amelyek belső kötései gyengék.
  • Kerüljük el a primer dimereket és a belső önálló konformációkat:

conformations

  • Igazoljuk primerjeinket e-PCR segítségével, UCSC Genome Browseren.
  • Ha lehetséges, annotált adatot használjunk, hogy elkerülhessük az SNP-effektust.
  • Ha géneket PCR-ezünk (mRNS – cDNS), akkor olyan exonokat válasszunk, amelyek minden alternatív splicing variánsban megvannak (batch assay vagy common assay néven az UPL Design Centerben).

Sok szerencsét és sikeres próbálkozásokat 🙂

Lilla

Restrikciós analízis (Restrikciós enzimek)

In molecular biology on August 27, 2013 at 2:22 pm

A restrikciós analízis olyan molekuláris biológiai módszer, melyhez restrikciós endonukleázokat, röviden restrikciós enzimeket alkalmaznak.  A restrikciós enzimeket plazmidok hasítására használják.  Ezek az enzimek a baktériumban immunfunkciót látnak el. A baktériumban páronként jelennek meg: DNS metiláz és maga a restrikciós enzim vagy más néven endonukleáz. Mindketten ugyanazt a szekvenciát ismerik fel.  A baktérium szekvencia specifikus módon metilálja a saját DNS-ét. Ezáltal az védett lesz minden más idegen DNS-től.  Minthogy a horizontális génátvitel eléggé gyakori a baktériumban, így az meg tudja védeni a saját genetikai anyagát a restrikciós enzimek segítségével.  Az idegen DNS belépve  a sejtbe eltérő DNS metiláló mintát fog bemutatni. A metilálatlan felismerési szakaszt a restrikciós enzim levágja és ezáltal tönkreteszi.

A különböző baktérium törzseknek különböző restrikciós enzimei vannak, melyeknek  eltérő a felismerési szakasza ( természetesen mindegyiknek van DNS metiltranszferáza is).

Egy molekuláris biológiai laborban arra használjuk a restrikciós enzimeket, hogy hasítsuk és ezáltal manipuláljuk a plazmidokat.  Olyanok mint az olló, ami a rá specifikus részeket tudja kivágni a plazmidból, hogy megtisztítsa azt.

A restrikciós endonukleázoknak három típusa ismert: az I. III.  típusok molekuláris biológiai szempontból már nélkülözhetőek, míg a II-es típus nélkülözhetetlen.

Tulajdonságaik:

  •  csak endonukleáz aktivitásuk van, azaz a metilálást mindig egy másik enzim fogja végezni. A II-es típusnál van egy módosító enzimpár is a metiláló mellett.
  • mindig ugyanott, ugyanúgy, adott enzimre jellemző felismerési szekvencián belül vagy annak közelében hasítja a DNS-t
  • működésükhöz ATP nem szükséges, Mg2+ viszont kell!!!

Isoschizomereknek nevezzük azokat az enzimeket, amik azonos szekvenciát ismernek fel és azonos helyen hasítanak.

Neoschizomereknek nevezzük azokat az enzimeket, melyeknek csak a felmerési szekvenciájuk azonos, hasítási helyük különböző.

Nézzünk meg néhány alap restrikciós enzim használatot:

YOUTUBE – Restrikciós enzimek

Mindig amikor enzimekkel dolgozunk feltétlen gumikesztyűt kell húznunk, és az enzimet jégen tartanunk!!!

A restrikciós enzimek egysége a U (unit) az a mennyiség ami ideális körülmények között, egy óra alatt egy mikrogramm plazmid hasításához szükséges.

Egy tipikus restrikciós enzimmel végzett reakciót az alábbi példán szemléltetjük:

Hasítást végző restrikciós enzim:  EcoRI.

Jelentése: E= nemzetség Escherichia

co= faj coli

R= törzs

I= elsőként izolált endonukleáz

Protokoll ( minden gyakorlat előtt egy tervet készítünk,hogy mi szerint végezzük majd a feladatunkat ) :

1. A restrikciós reakció komponenseit jégre tesszük és kiolvasztjuk. Az enzimet glicerollal együtt tároljuk Eppendorf csövekben -20°C-on. A glicerol azért szükséges,hogy az enzimünk ne fagyjon meg. Használat előtt az enzimet tartalmazó csövet vortexeljük,hogy kicsit felkavarjuk.

2. Összemérjük jégen a reakciókat. Példánkban a végtérfogat 50 ul.

Így ennek megfelelően 37 ul NFW-t (nukleáz mentes vizet), 5 ul 10x-es hígítású   EcoRI puffert, 7ul 1ng-os templát DNS-t és 1ul 10U/ul-es enzimet mérünk össze.

3. Ezt követően 30 percig inkubáljuk 37°C-os vízfürdőben.

Néhány általános szabály amit jó tudni :

  • az enzim a lehető legrövidebb ideig tartózkodjon -20°C feletti hőmérsékleten
  • az enzim glicerolban oldott, és az gátolhatja a hasítást, így általános szabály, hogy a teljes reakciótérfogat max. 10%-a lehet az enzim
  • enzimenként eltérő a puffer összetétele
  • a reakció utolsó hozzáadott komponense mindig az enzim!!!
  • ha tovább szeretnénk vinni a reakciót pl. ligálási reakcióhoz,  célszerű hőinaktiválni ( ált. 65°C, 20 perc, enzimfüggő )
  • lehet egy csőben dupla hasítást végezni, de ekkor figyelni kell a pufferegyeztetésre
  • szuboptimális körülmények közt “star” aktivitás jelentkezik

Belepillanthatsz a módszer alkalmazásába az alábbi videóban.

YOUTUBE – Restrikciós emésztés és klónozás

Sok szerencsét!

Andi és Flóra

Tons of Resources for High Resolution Melt Analysis

In molecular biology on August 28, 2011 at 10:33 am

In this self-guided slideshare presentation you will  learn the basics of High Resolution Melt Analysis HRM, applications, important considerations, assay

via Tons of Resources for High Resolution Melt Analysis.

Transformation of competent cells

In DNA, GFP, molecular biology, plasmid, Resources, Restriction Enzyme, transformation on March 16, 2011 at 4:53 pm

Scientific Background

Transformation is the process of introducing foreign DNA (e.g plasmids, BAC) into a bacterium. Bacterial cells into which foreign DNA can be transformed are called competent. Some bacteria are naturally competent (e.g B. subtilis), whereas others such as E. coli are not naturally competent. Non-competent cells can be made competent and then transformed via one of two main approaches; chemical transformation and electroporation. It is important to note we have tested transformations of the distribution kit with this protocol. We have found that it is the best protocol. This protocol may be particularly useful if you are finding that your transformations are not working or yiedling few colonies.

In nature what happens is shown on the following two videos:

Overview

To see this in a nice lab demonstration tutorial about how transformation procedure is used, and why, watch this:

Materials

The demonstration of our iGEM protocol realized in summer 2009 is shown below:

Competent cells (we use DH5α)

DNA (this is a sample)

Ice

42°C water bath

37°C incubator

SOC (check for contamination!!)

Petri dishes with LB agar and appropriate antibiotic

Procedure

1. Start thawing the competent cells on crushed ice (we find this cells in the -70°C fridge)

2. Add 200μl competent cells and 2 or 5μl (50ng) DNA on ice

3. Incubate the cells for 30 minutes on ice

4. Heat shock at 42°C for 90 seconds water bath (not shaker)

5. Incubate for 5 minutes on ice

6. Add 200μl SOC broth (but sometimes not)

7. Shaker 2 hours at 37°C

8. (Sometimes centrifuge for 10 minutes at 10000 rpm and a few supernatant take int he dumb and suspendation the pellet)

9. Plate usually 60μl of the transformation or we make distribution 20μl and 200μl Petri dishes with agar and the appropriate antibiotic(s) with the part number, plasmid and antibiotic resistance

10. Incubate the plate at 37°C for 12-14 hours

Notes & troubleshooting

If you think another video demonstration would be needed, please go on to the next video:

More details about the procedure, with excellent links cand resource material can be found in the Molecular Biology Online Notebook.

References

1. Sambrook, J., E.F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed.,1.25-1.28. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, NY, USA.

Synthetic Biology to solve Global Health Challenges

In molecular biology on March 15, 2011 at 8:48 pm

The Bill & Melinda Gates Foundation is now accepting grant proposals for Round 7 of Grand Challenges Explorations, an initiative to encourage innovative and unconventional global health solutions. Applicants can be at any experience level; in any discipline; and from any organization, including colleges and universities, government laboratories, research institutions, non-profit organizations and for profit companies.

Grant proposals are being accepted online until May 19, 2011 on the following topics:

* Explore Nutrition for Healthy Growth of Infants and Children
* Apply Synthetic Biology to Global Health Challenges
* The Poliovirus Endgame: Create Innovative Ways to Accelerate, Sustain, and Monitor Eradication
* Create the Next Generation of Sanitation Technologies
* Design New Approaches to Cure HIV Infection
* Create Low-Cost Cell Phone-Based Solutions for Improved Uptake and Coverage of Childhood Vaccinations

Initial grants will be US $100,000 each, and projects showing promise will have the opportunity to receive additional funding of up to US $1 million.  Full descriptions of the new topics and application instructions are available at: http://www.grandchallenges.org/gce/

We are looking forward to receiving innovative ideas from around the world and from all disciplines. If you have a great idea, apply. If you know someone else who may have a great idea, please forward this message.

Thank you for your commitment to solving the world’s greatest health challenges.

###
Bill & Melinda Gates Foundation

Guided by the belief that every life has equal value, the Bill & Melinda Gates Foundation works to help all people lead healthy, productive lives. In developing countries, it focuses on improving people’s health and giving them the chance to lift themselves out of hunger and extreme poverty. In the United States, it seeks to ensure that all people – especially those with the fewest resources – have access to the opportunities they need to succeed in school and life. Based in Seattle, the foundation is led by CEO Jeff Raikes and Co-chair William H. Gates Sr., under the direction of Bill and Melinda Gates and Warren Buffett.

Cell passaging video

In cell culture, iGEM, Lab equipment, molecular biology, Resources, sterile, video on March 9, 2011 at 9:48 pm

We think videos can help a lot for newcommers into the molecular biology laboratory.

One of the goals of our team (iGEM Debrecen 2010) was to generate high quality videos of basic lab protocols. All the protocolls can be viewed here but you can have an intro into Cell passaging righ now if you watch this video:

Sizes in Biology

In animation, cell, Cool stuff, DNA, molecular biology on June 30, 2010 at 6:09 pm

Dear colleagues,

An excellent tool is available to get a feeling about molecular sizes in Biology.

The tool is available here and was developped by “Learn Genetics” program from the University of Utah.

You can have a short movie on it below, but please check the original one from here!!!

PCR or the Polymerase Chain Reaction

In animation, DNA, molecular biology, PCR, plasmid, Polymerase, Polymerase Chain Reaction, Replication, Taq on April 12, 2009 at 6:25 pm

When I first heard about the Polymerase Chain Reaction my first association was with the atomic bomb chain reaction. You know probably from your studies: the labile Uranium if receives a neutron it transformed to a stable Uranium isotope while several new neutrons are released. If these newly release neutrons meet novel labile Uranium atoms the reaction is amplified, more and more neutrons will be released until the system if is lost from control explodes in the form of an atomic bomb. If the reaction is under control we can produce heat and through this electricity in an electric plant, if the critical mass of the labile isotope is ignited with a neutron beam, it will explode.

You can have two excellent representations of the chain reaction below:

The chain reaction

But this is a blog about techniques in the molecular biology lab, so we will not deal with the fission chain reaction but we will see how a similar type of amplified reaction is produced with the DNA by specific enzymes in a reaction tube. The enzymes that can do a chain reaction are the Polymerases.

What is the function of polymerases? We have them in each of our cells. They do the most basic reaction that keeps life going on from the start of the very first organism ever. They are duplicating in a semi-conservative way the DNA in order to allow the transmission of the genetic information during cell division.

You can have an animation about DNA replication below.

What is the Polymerase doing?

The two DNA strands are connected by hydrogen bonds and code for the same information by the A:T and C:G base pairing.  The two strands are anti-parallel if we look to the double strand from one direction one of the strands will be in 5′-3′ direction and the other vice-versa in 3′-5′ direction. As an important rule we have to know that in nature all polymerases are doing the DNA synthesis in the 5′-3′ direction. The strand that can be replicated according to this rule is the leading strand. The other one is called lagging strand. The problem is that both strands have to replicated in by the same protein complex! But how can one single Replication complex produce the leading strand and the lagging strand in the same time ? We arrived to the problem of the the Okazaki fragments.

In the animation below you can find a good representation about how a single Replication complex can do the synthesis of the two different strands.

In order to speak about PCR we have to go out to trip to check some Geysers.

So let us check first the big Steamboat Geyser.

Yellowstone Steamboat Geyser

If we go closer to one of the hot springs we might see that the water is “living”, there are some algae, micro-organisms in this water. Let’s have a look:

The Yellowstone Hot Springs

These micro-organisms are living in really hot water. But if they are living, they should replicate, and if they replicate, they should have DNA polymerases!

These micro-organisms were isolated and one of them, called Thermo aquaticus (sometimes named Thermophilus aquaticus) became really famous. It has a polymerase that is used in vast majority of the in vitro DNA replication processes and in PCR.

I am sure you all have an idea already about PCR. We put all reagents needed for a DNA replication in a tube and reproduce the normal DNA replication process. So what do we need? We need a DNA template an oligonucleotide as a primer, the building blocks of the DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP or in general dNTP -deoxi nucleotide tri phosphate), Mg and the Polymerase. If possible from Thermo aquaticus, which is called Taq.

There is one trick! This one trick was invented by Kary Mullis and he received Noble Prize for this single idea. The trick is, that we will not reproduce completely the natural reaction. We do not want to bother with leading strand and lagging strand and with all kind of Okazaki fragments and helicases and ligases.

The idea of Kary Mllis was that if you separate the double strand and design two oligos that will bind the two different strands but will look towards each other, than the product will be doubled. If you separate the strands by heating the solution to 95C you can repeat the reaction, and now you will have 4 copies. In the next run 8 copies and so on in each reaction you will have 2 on the power of the “cycle number” copies in a chain reaction fashion!!!

Let us have a really simple and good introduction to the whole procedure in the next two animations:

Below you can find a more fancy animation of the same procedure:

For this idea Mullis got the Noble Prize. His work changed completely the history of molecular biology. Let us check an interview with him about how he discovered PCR:

What is the practical use of this whole method?

Amplifying DNA by PCR became one of the most widely used method in a molecular biology lab. You can use it for transferring DNA from one plasmid to a different one, to introduce mutations and even to measure the amount of a specific gene in a sample. By combining it with a Reverse Transcription reaction we can measure copy numbers of RNA molecules.

Below we can see an example of how it is used in criminal justice!

In the next video you can see the workflow of DNA sequencing with a New Generation sequencing machine. What is remarkable here is that the designers of the instrument are skipping the cloning of the DNA fragments into plasmids and amplification of the plasmids by bacteria. They use micro reactors in the form of an emulsion PCR. One oligo is on a bead and the DNA binds the oligo. Each bead is fused with a small droplet that contains all the other reagents for the PCR. By this trick you will have a clonal amplification of the DNA fragments. One bead will contain on  type of DNA and you skipped all bacterial work. The result is that you can sequence the whole human genome in a couple of weeks for less the 100k USD. Or you can sequence a bacteria in a day…

Emulsion PCR in the FLX sequencer workflow

At the end of this lesson, lets have some fun and see the celebration of the PCR!

Hunting Viruses

In cell culture, DNA, molecular biology, RNA, virus on March 30, 2009 at 6:02 pm

If it comes to speak about the future possibilities of molecular biology, it is worth keeping an eye on the medical applications. And if you think about the most peculiar infection agents you should for sure think of viruses also. What is a virus? Of course we all know what a virus might cause to us, like a simple respiratory infection. These are usually caused by viral infections that later are super infected with bacteria. I had a professor who tried to explain us what a virus is. It skips almost any definitions. We can not be sure if we could consider a living thing at all!!! At the end he told us in a laconic way: a virus is a VIRUS! Nothing more.

If we try to find them it is good to know, that they were discovered through the observation that you can transfer an infection from one cell culture to the other even after filtrating the solution through a filter with 0.4 micrometer holes. That means that no bacteria can bypass this filter, but infections can be transferred with this solution. The firs experiments were done in order to monitor these infections, to see that after infection there was a “clean window period”, a period when the infections agent disappeared from the cell culture. After this window the virus reappeared and the supernatant solution had infections properties again.

Today we know plenty of details about viruses. There are basically two flavours of them DNA and RNA viruses. So that is an important point! because we have plenty of molecular biology tools that allow us to characterize nucleic acids. One of the most complex tool from this series is the DNA microarray. As one of my students pointed out last week, in the next video from TED, we can have a wonderful presentation about how these tools can be used in a fast and relatively easy way to get a deeper insight in the world of viruses. As a perspective the video shows us some excellent diagnostic applications that will be probably used to develop state of the art diagnostic tools in the next couple of years.

So, let us see how it works!

More info about the viruses and vaccination, here.