Kvantitatív PCR alapok

A qPCR technika (Real-Time, azaz valós idejű, kvantitatív) a nukleinsavak (DNS vagy cDNS) relatív/abszolút mennyiségi meghatározásának ún. “gold standard”-je. Alapelve nem különbözik a hagyományos, végpontos PCR-től, azonban van egy alapvető különbség: a fluoreszcens festékek használata. Ezek segítségével valós időben, a PCR ciklusok során, valós időben detektálható az aktuális DNS mennyiség az akkumulálódó fluoreszcens jel által. A fluoreszcens festékek közül elsősorban a SyBrGreen-t alkalmazzák, amely interkalálódik, így minden duplaszálú DNS-hez kötődik, ezáltal mind a primer dimerek, mind az aspecifikus amplikonokat kimutatja. Ezzel szemben a szekvencia-specifikus próbák, mint a “molekuláris fáklya” (Molecular Beacon), Skorpió és TaqMan hidrolízis próbák a két PCR primer közötti szekvenciához kötődve csakis a célszekvencia amplifikációját jelzik.

Kísérleti céltól függően különböző módon kell PCR primereket terveznünk. Genomi DNS esetén elsődleges fontosságú annak szem előtt tartása, hogy génre végzett PCR esetén tartalmazza az intronokat, így intron-exon határra tervezett primerekkel elkerülhető, hogy RNS amplifikálódjon. RNS abszolút vagy relatív kvantitálása esetén célszerű két szélső exonra tervezni, biztosítva, hogy az intronokat tartalmazó genomi DNS ne sokszorozódjon egyszerűen amiatt, mert az áthidalandó távolság a két primerpár közt túl nagy. Mindkét esetben figyelni kell az SNP-k jelenlétére, amelyek egyes esetekben teljesen meghiúsíthatják a reakciót.

A UPL rendszer

Laboratóriunkban évek óta az úgynevezett UPL rendszert használjuk.  Az itt mért adatpontok nagy része valószínűleg qPCR mérésekből származik, így hasznos lehet áttekinteni az esszétervezés szabályait. A UPL rövidítés az “Universal Probe Library” elnevezésből származik, amely kifejezés onnan ered, hogy olyan oligo szettet forgalmaznak (Roche), amely 165 különböző fluoreszcens hidrolízis próbát tartalmaz. Ez a szett teljes mértékben lefedi az eddig szekvenált genommal rendelkező összes élőlény transzkriptjeit azáltal, hogy a transzkriptek leggyakoribb 8-mer és 9-mer motívumait gyűjtötték össze. Így ha qPCR-t tervezünk, nincs szükség manuálisan megtervezni a próbát, hanem a Roche weboldalán elérhető “Assay Design Center”-ben a megfelelő lépések sorozatát követően a kívánt transzkriptre megkapjuk mind a legoptimálisabb PCR primerpárok szekvenciáját, mind az ezekhez ajánlott UPL próba számát. A laborunk rendelkezik ezen UPL próbák közül 90-nel, amelyek a teljes humán genomot lefedik. Ezen próbák jellegzetessége, hogy elkészítésükkor az ún. LNA technikát alkalmazták, amely annyit jelent, hogy olyan nukleotid-analódokat használtak szintéziskor, amelyek kémiailag erősebben kötődnek a templátjukhoz, mint a konvencionális oligonukleotidok. Erre azért van szükség, hogy kellően magasan tarthassuk a Tm-et rövid próbák mellett is ( a UPL próbák átlagosan 8-9 nukleotid hosszúságúak). Az LNA-król bővebben a következő linkeken olvashatnak, angol nyelven: 1., 2. A UPL rendszer leírása szintén angolul: itt.

A UPL Assay Design Center használata

Az elkövetkezőkben végigmegyünk egy példán keresztül a qPCR esszétervezés folyamatán. Az esszétervezés egy egyszerű webes felületen valósítható meg, amely a Roche oldalán, az alábbi közvetlen linken érhető el: UPL Assay Design Center. A linkre kattintva egy új ablakban meg fog jelenni a tervezőközpont főoldala, ahol alapbeállításokat végezhetünk. Az oldal a következőképpen néz ki (kattintással nagyítható):

A főoldalon 3 fő lépés olvasható:

• válassza ki az organizmust
• vigye be a szekvenciát (copy&paste, szekvencia név vagy adatbázis ID alapján)
• nyomja meg a “Design” gombot

Valóban ennyire egyszerű. A szekvenciabevitelnél esetünkben az adatbázis ID-t használjuk. Az ENSEMBL egy gén alapú genomböngésző, olyan genomi információkat tartalmazó, gazdagon annotált adatbázis, amely a genetikusoknak, molekuláris biológusoknak, és általában a genommal foglalkozó kutatóknak biztosít kiváló információforrást projektjeikhez. Többek között információt kaphatunk az adott pozíciókban fellelhető SNP-kről és az adott organizmusban megtalálható transzkriptekről (különböző RNS-ek, alternatív splice variánsok, exon-intron struktúra és egyebek). Így ha az ENSEMBL segítségével terveztetünk esszét a tervezőközpontban, biztosak lehetünk benne, hogy mindenre kiterjedően történik a primerek kiválasztása. A genomböngésző főoldala a következő linken érhető el: ENSEMBL.

Az ENSEMBL oldalán első lépésként bal oldalon ikonokon keresztül, vagy legördülő menüből ki kell választani azt a fajt, amelyből qPCR-t tervezünk, ezt követően egy új oldalon megjelenik a génspecifikus keresési felület. Esetünkben az egér IL-6 génre tervezünk qPCR esszét (kattintással nagyítható):

A “Go”-ra kattintva megjelenik az adott génre  többféle tulajdonság. Ezek közül a “Gene”-re kattintunk:

A linkre kattintva több eredményt is kaphatunk. A leírásukból megállapíthatő, hogy csak az első(néhány) a keresett gén, a többinek csak valamilyen biológiai kapcsolata van a sejtben a választott géntermékkel. Esetünkben a második találat az IL-6 receptorának génje.  Az első találatot választjuk, rákattintva a Gene ID-ra:

Ennek következtében a következő oldalra jutunk, amelyen a gén különböző tulajdonságait találjuk, az alternatív transzkriptekkel együtt, amelyek egy táblázat formájában jelennek meg. Ezeket egyenként megtekintve kiválasztható, hogy melyikre érdemes az esszét tervezni. Például lehetséges, hogy egyes transzkriptek “bizonytalanok”- van, amelyik nem íródik át fehérjévé, van, amelyik korán lebomlik és szintén nem eredményez fehérjét. Más esetben a kódoló szekvencia nem teljes. Minden esetben a bejegyzéseket egyenként kell ellenőrizni, így megtudhatjuk, melyik szakasz az, amely pl minden teljes értékű splice variánsban benne van. Esetünkben egy transzkript van: ENSMUST00000026845.

Térjünk vissza a UPL oldalára: UPL Assay Design Center.

A főoldalon válasszuk ki az organizmust (egér), majd a megjelenő oldalon másoljuk be a talált ENSEMBL azonosító(ka)t – ha többet is választottunk, akkor azokat vesszővel elválasztva írjuk be a boxba –  majd válasszuk ki az “intron spanning assay”-t alul, hogy a genomi DNS ne zavarjon be a reakcióba:

A lap alján található “Design” gombra kattintva a szoftver újra rákérdez, hogy milyen transzkriptekre tervezünk. Az előzőeket bejelölve rákattintunk ismét a “Design” gombra. A következő eredményt kapjuk:

A program kiad egy-egy primerszekvenciát és az ajánlott UPL próba számát (#6). Az alsó összefoglaló ábrán látható a két primer és a próba elhelyezkedése az RNS-en belük, valamint jelölve vannak a SNP-ek. A “PDF report gomb megnyomásával PDF formátumban letölthető a tervezett esszé.

A következő, minőségi kontroll lépés az esszé ellenőrzése az UCSC Genome Browser-en (e-PCR). Ez a genomböngésző alkalmas (sok más mellett) arra, hogy megnézhessük az adott génen a primerek orientációját, hogx valóban intron-átérő-e (intron-spanning) stb. A UCSC e-PCR oldala a következő linken elérhető: UCSC in silico PCR.

A fent pirosan keretezett részt kell kitölteni, egyrészt a fajnévvel, az adott fajhoz tartozó genom “assembly”-vel ( ált. a legújabbal), targetként RNS mérés esetén a “UCSC genes”-t választjuk. A két primert is bemásoljuk és a “submit”-ra kattintva megkapjuk a szekvenciát, amit meg lehet jeleníteni: a “keletkezett” PCR terméket jelöltem piros kerettel az alábbi képen – jól látszik, hogy megfelel az elvárásainknak, megfelelő orientáltságúak a primerek és intronnal elválasztott exonokon vannak a primerek.

Ezt követően megrendelhetjük a HPLC-tisztított primereket. Célszerű 2-3 esszét tervezni azonos génre, mert tapasztalataink szerint ezek 2/3-a nem, vagy csak optimalizálás után működik jól.

Általános qPCR szabályok:

• Az amplikon (termék) hossza a lehető legrövidebb legyen (60-70 bp ideális, de mindenképpen 100 bp alatt).

• A primerek Tm-je 60°C körül legyenek, míg a próbáé 10°C-kkal felette.

• Az oligo és a próba közötti távolság minimális ekell, hogy legyen, mivel a Taq polimeráz exonukleáz aktivitása így a legnagyobb.
• Az oligok Tm-je (GC-tartalom)  a lehető legközelebb legyen egymáshoz.
• A két primer 3′ végének utolsó 5 nukleotidjai között a GC-tartalom lehetőleg identikus legyen.
• Olyan oligo szetteket válasszunk, amelyek belső kötései gyengék.
• Kerüljük el a primer dimereket és a belső önálló konformációkat:

• Igazoljuk primerjeinket e-PCR segítségével, UCSC Genome Browseren.
• Ha lehetséges, annotált adatot használjunk, hogy elkerülhessük az SNP-effektust.
• Ha géneket PCR-ezünk (mRNS – cDNS), akkor olyan exonokat válasszunk, amelyek minden alternatív splicing variánsban megvannak (batch assay vagy common assay néven az UPL Design Centerben).

Sok szerencsét és sikeres próbálkozásokat 🙂

Lilla