Bevezetés:

A spektrofotometria az egyik legelterjedtebb anyagvizsgálati módszer. Az igen sokféle mérési technika közös alapja az, hogy az anyagok molekuláris,- atomi szintű energia átmenetei kvantáltak és ezek az energiaszintek jellemzőek az adott anyagra. Az egyes energia-átmenetekhez meghatározott hullámhosszak (elnyelt vagy kibocsátott) tartoznak a E=hν=hc/λ összefüggés alapján. Ha megvizsgáljuk egy gerjesztett állapotban levő anyag sugárzásának, a hullámhossz szerinti eloszlását (spektrumát), abból következtethetünk részben az anyagi minőségre, részben az anyagmennyiségre, sőt némely esetben a molekula-szerkezetre is. Ezt emissziós színképelemzésnek nevezzük. Ugyanez a cél az abszorpciós fotometriában, itt egy alapállapotú anyagot világítunk át valamilyen folytonos sugárzással és az átbocsátott/elnyelt sugárzást elemezzük. Legegyszerűbbek és legelterjedtebbek a látható fénnyel történő mérések, de a szerves molekulák vizsgálatára az infravörös tartományba eső rezgési színképeket használják.

Az anyagok spektroszkópia szempontjából fontos tulajdonsága a szín, amely szoros összefüggésben van molekula-szerkezetükkel. Sznesnek akkor nevezünk egy anyagot, ha a ráeső fényből szelektíven abszorbeál, vagy szelektíven ver vissza. Ha pl. valamely anyag a fehér fényből a vöröset nyeli el, akkor a többi spektrum szín keverékét, vagyis a zöldet engedi át vagy veri vissza. Lehetséges az is, hogy az anyag az ultraibolya vagy az infravörös tartományban abszorbeál, ezt szemünk nem érzékeli, az ilyen anyagokat színtelennek látjuk.

A nukleinsavak mennyiségi meghatározásához leggyakrabban a 260 nm-en mért elnyelési értéket szokták figyelembe venni. Ez a legegyszerűbb, leggyorsabb és legelterjedtebb módszer az RNS és DNS tartalom megállapítására. A tiszta nukleinsavak jellegzetes elnyelési profilt mutatnak 230 és 320 nm között. 320 nm-nél a tiszta nukleinsav-mintának nincs már elnyelése. A normális görbétől való eltérés szennyezők jelenlétére utal. Az elnyelés egyenesen arányos a minta RNS vagy DNS tartalmával. A nukleinsavak abszorpciós maximuma 260 nm-nél látható. Az elnyelés mértékéből a koncentráció a következő egyenlet alapján számítható:

μg (RNS) / ml = A₂₆₀ × hígítás × 40,

ahol

A₂₆₀ = elnyelés (abszorpció, optikai denzitás) 260 nm-nél (OD₂₆₀)

hígítás = a hígítás mértéke, pl. tízszeres hígításnál 10

40 = az RNS átlagos extinkciós koefficiense (40 μg / OD₂₆₀).

A pontos érték függ a pH-tól, illetve közvetett módon az azt befolyásoló tényezőktől. A kettős szálú DNS koncentrációja hasonlóan számolható (50 μg / OD₂₆₀), de mivel a timin és az uracil extinkciós koefficiense különbözik, a DNS-szennyezett RNS-oldat, ill. az RNS-szennyezett DNS-kivonat elnyeléséből helytelen adat számolható.

A spektrofotometriára manapság leggyakrabban használt eszköz a NanoDrop. Amelyek nagy előnye, hogy nem küvettában, hanem két száloptika között mágnes segítségével kifeszített egyetlen cseppben mérik egy adott oldat elnyelési tulajdonságait. 0,5-3 μl minta elegendő a méréshez, ami nem elhanyagolható előny egy 20-60 μl végtérfogatú nukleinsav-kivonat esetén. A készülék a mérés után a 220 és 350 nm közötti spektrumot is kirajzolja, ill. a helyes beállítás mellett ng/μl mértékegységgel azonnal kijelzi a minta nukleinsav-tartalmát is.

Használat

Előkészítés

A munka megkezdése előtt fontos a munkavégzéshez szükséges anyagok s eszközök odakészítése. A mérés során 10 μl-es pipettára, 10 μl-es pipetta hegyre, NFW-re (nuclease free water), kis papírtörlőre, s persze magára a mintára lesz szükségünk. A NanoDrop, s a hozzá kapcsolódó számítógép kizárólag gumikesztyűben használható!

Program indítása

A számítógép asztalán a NanoDrop 1000 ikonra kattintva indítjuk el a programot. Ekkor a következő ablak jelenik meg, ahol a felhasználó illetve a mérni kívánt anyag állítható be. DNS/RNS mérése esetén a Nucleic Acid menüpontot válasszuk ki.

Kezelőfelület, használat

A megjelenő ablak jobb felső sarkában (Sample type) állítható be a mérni kívánt nukleinsav. Alatta adható meg a minta „neve” (Sample ID). Nagyon fontos, hogy ez egy olyan kód legyen, mely tartalmazza a mérést végző személy nevét, a mérés dátumát, s a minta azonosítóját.  A következő sorban a mérések sorszáma látható, ez automatikusan sorszámozza a méréseket. Az ablak jobb alsó sarkában a minta nukleinsav tartalma látható ng/μl mértékegységben.

A program indításakor az inicializáláshoz 1-5 μl NFW-t pipettázunk a minta felviteli felületre, ráhajtjuk a kart majd az OK-ra kattintunk, a folyamat indításához. Utána kis papírral mindkét felületet alaposan megtöröljük. Ezt követően további mosásokat végzünk. Továbbra is 1-5 μl NFW-t viszünk fel (vagy olyan oldatot, amelyben a nukleinsav fel van véve, pl. különböző DNS-tisztító kitek esetén bizonyos sóoldatok), majd „Blank-ra” kattintva végezzük a nullázást (háttérfelvétel). Ezt követően már mérhetjük a mintáinkat, melyből 1-2 μl-t használunk. Figyeljünk a név beállítására, s a minták közt alaposan töröljük meg a felületet.

Ha végeztünk a mintákkal, eredményeinket megtekinthetjük a „Show-report-ra” kattintva, továbbá kinyomtathatjuk a „Print-report” segítségével.

Minőségellenőrzés:

Érdemes az eredményeink elemzésénél ellenőrizni az OD 260/280 és OD 260/230 arányt, melynek a nukleinsav minták minőségi mutatói. A következőket érdemes tudni ezen számarányokról:

– A 260/280 arány protein, fenol vagy egyéb, 280 nm-en abszorbeáló szennyeződés jelenltére utal: RNS esetén 2.0, DNS esetén 1.8 tekintehtő teljesen tisztának.

– A 260/230 arány elsősorban partikuláris szennyeződésekre utal: általában mind DNS, mind RNS esetén magasabb, mint a 260/280 arány, általánosan 1.8-2.2 között mozog. Ha ennél alacsonyabb, az jelzi a kontaminációt.

Ezt követően a kikapcsolás előtt, 3x mossuk a gépet, megkönnyítve ezzel azon kollegánk (vagy épp a magunk) dolgát, aki utánunk következik. Épp ezért ne felejtsük ezt el! Végezetül a jobb felső sarokban lévő „Exit-re” kattintva léphetünk ki a programból.

A leírást Pataki Zoltán készítette.

Lektorálta: Ozgyin Lilla.