Az elektroforézis elvi alapjai

Töltéssel rendelkező részecskék elektromos térben töltésüknek megfelelő irányban mozognak. A pozitív töltésű kationok a negatív katód, míg a negatív töltésű anionok a pozitív anód felé haladnak. Az elektródok felületéhez érve az ionok töltésüket elvesztik.  Elválasztástechnikai szempontból az ionok áramlása, az ún. elektroforézis a lényeges, az ionok semlegesítődése az elektrolízis másodlagos kísérőfolyamatnak tekinthető.

Az ionok vándorlási sebességét töltéssűrűségük és az alkalmazott feszültség-gradiens nagysága szabja meg. A feszültség-gradiens egyenesen arányos a két elektród közötti feszültségkülönbséggel és fordítottan arányos az elektródok távolságával.  Az ionok töltéssűrűsége egyenesen arányos a nettó- töltéssel  és fordítva arányos a mérettel.

Az ionok eltérő töltéssűrűségük miatt eltérő sebességgel mozognak az elektromos térben, ami lehetővé teszi elválasztásukat. A töltéssel rendelkező ionok kialakulásának mértéke a közeg pH-jától függ.

Mindez lényegében azt jelenti, hogy minél kisebb egy ion tömege/mérete, annál gyorsabban tesz meg hosszabb távot a gélen, míg a nehezebb hosszabb idő alatt rövidebbet.

A katódon H_2, az anódon O₂ gáz keletkezik.

Az elektroforézisnek több típusa alakult ki a tudomány fejlődésével: szabad-határfelületű elektroforézis, zóna elektroforézis (hordozóval végzett), és végül az agaróz gél elektroforézis.

Agaróz gél elektroforézis

Az agaróz gélelektroforézis elsősorban nukleinsavak analízisére alkalmas módszer, egyéb kísérletes reakciók sikerességének ellenőrzésére szolgál: PCR, restrikció, szonikálás, DNS- és RNS-tisztítás. A nukleinsavak elválasztása elektromos erőtérben, hálózatos gélmátrixban, megfelelő nukleinsav referencia „létra” jelenlétében történik, detektálása fluoreszcens nukleinsav-festékkel történik.

A Thermo Scientific cég forgalomban lévő néhány “GeneRuler” létra

Az agaróz lineáris poliszacharid, melyet tengeri algából nyernek. Az alacsony olvadáspontú agaróz egészen kis DNS darabkák (50-500 bázispár) elválasztására is alkalmas, azonban az agaróz géleket általában nagyobb méretű molekulák szeparálására használjuk. A DNS vándorlási sebességét az agaróz gélben számos tényező befolyásolja. A DNS neutrális pH mellett negatív töltésű és az anód felé mozog. A nagyobb DNS darabok lassabban, a kisebbek gyorsabban mozognak a molekulaszűrő hatás miatt.

Ám a mérete mellett alakja is módosítja a vándorlás sebességét; a szuperhelikális, cirkuláris és lineáris DNS mozgékonysága az elektroforézis körülményeitől függő módon eltérő.

A gélben lévő DNS-t ethidium-bromiddal festik. A festék molekulái beékelődnek a DNS bázispárjai közé. A festék UV fényben láthatóvá válik, mivel 550 nm-en vöröses narancsszínű fluoreszcens fényt bocsát ki. A DNS festést legtöbbször az elválasztás után végzik, azonban meggyorsítható a detektálás úgy is, hogy az ethidium-bromidot már a gél készítésekor belekeverjük a gél anyagába. Az ethidium-bromid karcinogén, a vele való munka és a feleslegessé váló hulladék megsemmisítése nagy körültekintést igényel!

Ezért a laborban leginkább GelRed-et használunk DNS festésre, a gélhez a készítése során adjuk hozzá.

Agaróz gél készítése és öntése

 Gél készítése:

Általában 1%-os gélt szoktunk készíteni és önteni. Ez persze a végezni kívánt kísérlettől függ, ha a vizsgált nukleinsav rövid akkor töményebb, ha hosszabb akkor hígabb géllel kell dolgoznunk.

Kis futtatókáddal dolgozunk melybe mintafelvivő fésűt helyeztünk. Táramérlegen bemérünk 0,7 g agarózt, ezt beleszórjuk borszilikát üvegbe és ezt felöntjük 70 ml 1x TAE pufferrel. Ezt az elegyet mikrohullámú sütőben felmelegítjük annyira, hogy egy vízszerű, áttetsző agaróz szemcséket nem tartalmazó szirupszerű folyadékot kapjunk. Mindezt gyakori rázogatással érhetjük el gumi védőfogóval tartva az üveget hiszen nagyon forró. Az üveg kupakja végig rajta kell legyen meglazítva. Amikor kész ez az oldat akkor visszahűtjük az üveget kézmelegre és 1000x GelRed dsDNS (duplaszálú DNS) festéket adunk az agarózhoz. Az elegyet a kádba öntjük és az esetlegesen képződő buborékokat egy pipetta hegyének segítségével megsemmisítjük, ugyanis ha benne marad és úgy szilárdul meg az hibát okozhat a minta futásában.

Miután megszilárdult a gél a kádat 1x TAE pufferrel töltjük fel úgy, hogy fél cm-re ellepje a gélünket.

 Mintafelvitel:

Ált. 200-500 ng DNS már szép, látható jelet ad. Leggyakrabban Xylén-Cyanol loading dye segítségével tesszük láthatóvá a mintáink futását.

Az egyik vagy mindkét szélső zsebbe DNS létrát töltünk, majd sorban a mintáinkat. Gyorsan kell dolgoznunk, hogy ne diffundáljanak szét.

 Futtatás:

Ez a művelet úgy történik, hogy mivel tudjuk, hogy a DNS töltése negatív és ezért a pozitív irányba fog futni, ezért ennek megfelelő elrendezésben fedjük le az elektromos csatlakozókat tartalmazó fedővel a kádat és azokat csatlakoztatjuk is hozzá illetve a tápegységhez. A feszültség, futtatási idő változtatható a mintánk függvényében.

 Elektroforetikus berendezés

   A gél vizsgálata:

A DNS sávok detektálása UV átvilágító asztalon történik védőálarcban. A gélt az átvilágító lapra kell helyezni és rázárni a fedelet. Az UV fényben láthatóvá válnak a gélben lévő

DNS sávok. Ezek helyzete és intenzitása felvilágosítást ad a minta tisztaságáról. Ha a várt sávok mellett további sávok is láthatók akkor az szennyezettségre utal. A plusz sávok mennyisége a szennyezettség mértékével arányos. Lehet degradáció miatt, RNS szennyezettség miatt, minta szétfutása miatt stb.

 Fluoreszcensen jelzett DNS UV fényben

Az alábbi videóban megnézheted az elektroforézis folyamatát:

http://www.youtube.com/watch?v=ztKgyIqqA4U

 Sok sikert!

 Andi és Flóra

A számolás lényege, hogy a sejtszuszpenzióból (az az oldat, amiben a sejtek a lehető legegyenletesebben vannak eloszlatva) egy kis mintát veszünk, abban meghatározzuk a sejtszámot, és az így kapott értékből következtetünk a teljes mennyiségre. A meghatározáshoz – a mikroszkóp mellett – egy segédeszközt használunk, ez a Bürker-kamra.

Bürker-kamra felépítése:

Ez egy vastagabb üveglemezből és egy vékony fedőlemezből áll. A vastag lemezre finom beosztás van karcolva. A kamra olyan, hogy ha a fedőlemezt a vastag lemezre helyezzük és azt leszorítjuk, akkor pontosan 0,1 mm vastag rés marad közöttük. A vizsgálandó anyagot ebbe a résbe helyezzük be a fedőlemez felhelyezése után úgy, hogy a vastag lemezbe vésett H alakú mélyedés szárai között található négyzetnél a fedőlemez széléhez cseppentjük. Mivel tudjuk a rés vastagságát és a vastag üveglemezen levő beosztások távolságát, a beosztások és a fedőlemez által határolt bármelyik téglatest térfogatát meg tudjuk határozni, így meg tudjuk adni a térfogategységben található sejtek számát.

Taktikai segítség:

A számolást általában a bal felső sarokban 3 vonallal körülhatárolt négyzetben érdemes kezdeni. Ezt a lentebb látható képen kék négyzetek mutatják. A három vonal közzül azokat a sejteket számoljuk bele amelyek a középső vonalon vannak. Annak elkerülése érdekébe, hogy belezavarodjuk melyik sejtet is számoltuk, érdemes úgy csinálni, hogy azokat a sejteket is beleszámoljuk  amelyek a három vonallal körülhatárolt négyzetben felül és jobb oldalon középső vonalon vannak.A sejtek számolását balról jobbra végezzük. Általában 3 ilyen három vonallal határolt négyzetben határozhatjuk meg sejtek számát és ezeket átlagolva következtethetünk a teljes mennyiségre.

Jó munkát! 🙂

Dóri és Niki